欢迎访问云之羽生物科技公司的网站--原装黄曲霉毒素b1标准品供应商!

五年专注实验耗材

专注ELISA试剂盒、动物血液制品、标准品供应

全国咨询热线18317267598

科普文献

黄曲霉毒素b1提取方法

发布时间:2020-11-17 02:42:00作者:云之羽来源:云之羽点击:3966 次

        为了更好的研究黄曲霉毒素b1,要清楚它是如何产生的,接下来本文将为大家讲述一种黄曲霉毒素b1提取方法,供大家研究。
        要提取高浓度的afb1,以大米为培养基培养黄曲霉,分别在不同温度梯度(15℃、20℃、25℃、30℃、35℃)和湿度梯度(0%、80%、85%、90%、95%和100%)下培养。每天测量一次菌斑直径的变化(共测18次),然后采用Logistic(一级)和Ratkowsky(二级)模型对黄曲霉菌斑大小进行拟合和检验,最后借助响应面模型对黄曲霉产毒条件进行优化。结果显示,在35℃和100%湿度的培养条件下,只需培养16~17d即可获得直径较大的黄曲霉菌斑,提取黄曲霉毒素B,浓度为3312ng/mL,单位面积黄曲霉毒素B产量是优化前(1101。471ng/mL)的3倍。图5表4参18(文中所示图标,公式可以找销售索取)。
        黄曲霉毒素(Aflatoxins)为分子真菌毒素,是一种剧毒和强致癌物质,为迄今发现的各种真菌毒素中最稳定的一种1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为一类致癌物。黄曲霉毒素最易污染玉米、花生、花生油、大米、棉籽、禽蛋、肉、奶及奶制品,其次是小麦、高梁和甘薯。现已经确定的黄曲霉毒素有20余种,但是污染粮食的黄曲霉毒素主要有黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2,和M1等。在天然污染的粮食中以黄曲霉毒素B1(AFB1)毒性最大,量也最多,致癌性也最强,国际癌症研究机构已经将AFB1列为人类致癌物],AFB1属于肝脏毒素,诱发肝癌的能力比二甲基亚硝胺大75倍呗。AFB,的危害作用表现在多方面,它不仅是一种肝毒素和致癌剂,而且影响血液循环、造血和消化机能等问人类健康受AFB1的危害主要是由于食用被AFB1污染的食物。长时间食用含低浓度AFB1的食物被认为是导致肝癌、胃癌、肠癌等疾病的主要原因-6。以外,黄曲霉毒素与其它致病因素(如肝炎病毒)等对人类疾病的诱发具有叠加效应。
        深入研究AFB1的致病机理,就必须提取AFB1建立各种动物模型。目前已有针对相对湿度和温度建立黄曲霉(Aspergilus flavus)生长模型的相关报道,SamapundoL等建立了黄曲霉生长的相对湿度、温度模型口,彭坚等以小麦为基质建立了黄曲霉的生长预测模型四,但研究结果发现,菌斑直径并未随着产毒培养时间的延长而递增。为掌握黄曲霉的产毒规律,获得更高浓度的毒素,本实验以不同时间、温度和湿度为培养条件,用Logistic(一级)和Ratkowsky(二级)模型对黄曲霉产毒条件进行系统的优化。

      1材料与方法

        1.1材料

        1.1.1菌种黄曲霉菌标准菌株3。4409,购自中国科学院菌种保藏中心。点植接种于PDA试管斜面培养基,28℃培养2~3d供实验用。
        1.1.2培养基在大米培养基中添加不同量的甘油,分别制备相对湿度为0、80%、85%、90%和95%和100%的培养基
        1.1.3毒素检测试剂盒ELISA试剂盒购自北京营养源研究所。组成:AFB,抗原包被酶标板(96孔),抗体,酶标二抗,空白对照液,底物(1mgx6),底物液A,底物液B,终止液,PBS-T洗液。

        1.2方法

        1.2.1黄曲霉菌的培养条件及优化菌落生长实验]:用灭菌生理盐水清洗培养2~3d的黄曲霉菌落孢子,稀释。吸取10uL孢子稀释液点在相应湿度的大米培养基正中央,分别置于15
℃、20℃、25℃、30℃、35℃的培养箱中,每隔1d测量直径变化。
拟合生长模型的建立:1)模型的假设:孢子接种时,不考虑其初始直径差异,统一假设初始直径为1mm;并假设椭圆菌斑的直径为椭圆长轴与短轴的平均值。2)Logistic(一级)模型:采用Logistic(一级)模型]拟合实际测定的生长曲线:

        x(0=1+(-1)es(0S/≤n)
        用线性最小二乘法估计这个模型的参数和X:(公式图标联系销售)
        x其中,X为最大生长值,X为初始值,为比生长速率。用        Matlab7.0软件拟合1得到预测生长曲线的参数最大生长值和比生长速率。3)Ratkowsky(二级)模型检验:(二级)模型用经典的Ratkowsky方程]拟合1即最大生长速率随温度变化的函数关系:
        √uams =C1(T-Tamn)*{1-exp[C(T-Tma)]}
        式中1C、C、T和T分别是4个经验常数1T是微生物能生长的最低温度1T是微生物能生长的最高温度。说明温度较低时1比生长速率的平方根与温度呈线性关系。4)响应面法分析实验:用SPSS13。0软件对实验数据进行分析1比较各因素的值和可信度。根据各显著影响因素效应的大小、正负确定效应值(正效应的因素均取较高值1负效应的因素均取较低值)1用MATLAB7。0软件设计响应面实验1并进行数据处理1以获得培养较大直径菌斑的优化方案。
        1.2.2AFB1的提取在通风橱中1往每个培养黄曲霉菌的锥形瓶中加入100mL甲醇水(体积比为1:1)1用玻棒搅拌。超声萃取10min后1快速抽滤1收集滤液1摇匀1然后将滤液倒入球形瓶中1在45℃下将滤液旋转蒸发至大约5mL1最后经10000r/min、4℃离心15min1取上清1置于4℃冰箱中保存用甲醇水(体积比为1:1)稀释即可得到不同浓度的AFB。
        1.2.3ELISA标准曲线法测定AFB1浓度B-1]AFB1酶联免疫试剂盒平衡至室温1用1。5mL酶标稀释液稀释冻干酶标抗原6呵。用洗涤液洗板2次并拍干。按表1依次加入试剂。表1中11号孔为阳性孔12号孔为阴性孔13号孔为限量表1AFB,酶联免疫试剂盒试剂添加顺序表
        Table 1 The adding order of reagents for enzyme-linked immunoassay of AFB,次序加入量孔号Hole No。
        Order Dosage 1234 5 67 89101112150uLAAB待测试样稀释液Diluted samples to be tested
        2。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。摇匀Shaking。。。。。。
        3。50uLDCCCCCCCCCCC
        4。。。。。。。。。。。。。。。摇匀Shaking。。。。。。。。。。。。。。。。。。
        A:7%甲醇溶液;B:AFB,标准物质;C:酶标AFB,抗原;D:酶标AFB,抗原稀释液
        A:7%methanol solution;B:AFB,reference material;C:Enzyme-labelled AFB;D:Diluted enzyme-labelled AFB,孔,4~12号孔为试样孔。4~9号孔中分别加入50uLAFB1系列标准溶液,浓度分别为0ng/mL、0。                1ng/mL、0。25ng/mL、0.5ng/mL、1 ng/mL和2 ng/mL,10~12号孔中分别加入50uL不同浓度的AFB,提取液,再把酶标抗原溶液加于各孔中,摇匀,37℃温育30min。甩干后用洗涤液洗板5次,拍干。各孔分别加入50uL底液a(0。2g/L四甲基联苯胺)和50uL底液b(乙酸钠柠檬酸缓冲液),37℃显色15min,各孔分别加入50uL终止液,并于450nm波长处测定各孔吸光值A2]。以4号孔的吸光值A为分母,5~9号孔的吸光值A~4,为分子,以吸光值的比值为纵坐标,以6个AFB,标准溶液浓度的对数(1gC)为横坐标,绘制AFB,,的标准曲线,再以此标准曲线求出待测AFB溶液的浓度。

        2结果与分析

        2.1黄曲霉菌培养条件的优化

        2.1.1黄曲霉菌培养条件的Logistic(一级)模型拟合采用Logistic(一级)预测模型拟合各环境条件下测得的实际生长数据,得出各条件下黄曲霉菌落的生长预测值,拟合曲线如图1。由于湿度为0的阴性对照组中菌斑完全没有生长,所以不进行拟合。
        由表2可知,Logistic模型拟合生长值的拟合优度R2都达到0。98以上,因此可以作为预测黄曲霉生长的模型,接着以Logistic(一级)模型拟合数据为基础,建立二级模型。
        2.1.2黄曲霉菌培养条件的Ratkowsky(二级)模型检验黄曲霉菌在不同相对湿度条件下的比生长速率u对温度(二级)模型拟合曲线如图2所示。由图2可知,在15~35℃范围内,培养的黄曲霉生长速率的平方根与温度呈线性关系,生长率随温度的升高而增加,各线性模型的相关系数均达0。95以上,模型拟合度较高。
        2.1.3响应面法分析黄曲霉菌培养条件用SPSS13。0软件对实验数据进行分析,比较各因素的值和可信度。
        由表3可看出,温度、时间表现为正效应,湿度表现为负效应。可信度均大于95%,表现为极显著因此以下试验分别以确定的正最大温度(35℃)和负最大湿度(100%)为基础,进一步探讨时间因子的效应。
        由图3-A可以发现,在100%湿度下,菌斑的直径随温度的升高而增加,当温度达到35℃时达到最大值,接近200mm,而温度低于15℃时没有明显变化。在时间方面,发现100%湿度条件下培养16~17d,菌斑的直径即可达最大值,菌斑直径随温度和时间响应面的方差分析及其显著性分析的结果发现,该回归模型在a=0.01水平上显著(P~0),相关系数R2为0。9570,调整后的R2为0。9270,即表明该模型可以解释92.7%的响应面黄曲霉菌斑的变化,说明该响应面模型的拟合程度较好。
        由图3-B可知,在35℃条件下,菌斑的直径随湿度的增大而增加,当培养基的湿度达到100%时达到最大值,也接近200mm,而湿度低于90%时增长极为缓慢。菌斑的直径随时间的变化趋势和100%湿度条件下的试验结果一致,即培养16~17d后可达最大值。菌斑直径随湿度、时间响应面的方差分析及其显著性分析结果显示,该回归模型在=0。01水平上显著(P~0),方程的相关系数R2为0.9630,调整后的R2为0。9600,即表明该模型可以解释96。0%的响应面黄曲霉菌斑的变化,说明该响应面模型的拟合程度较好。
为进一步确定菌斑在最佳温度或湿度条件下的生长变化趋势,分别绘制了100%湿度条件下黄曲霉菌斑直径随温度和时间(Y=f(X,X))变化的响应等高线图,以及35℃条件下黄曲霉菌斑直径随湿度和时间(Y=f(X,X))的响应等高线图。从图4-A发现,在100%湿度下,当温度达到35℃时菌斑的直径达到最大值。当培养时间为16~17d时菌斑的直径可达最大值。根据图4-B可以发现,在35℃条件下,当培养基的湿度达到100%时菌斑的直径达到最大值。在35℃条件下培养16~17d后菌斑的直径可达最大值。
表4显示两个不同响应面模型的结论基本一致,增强了模型的可信度。本实验结果提示在35℃、100%湿度的培养条件下,培养16~17d可提取黄曲霉毒素。因此,后继试验按照以上结果培养和提取黄曲霉毒素。

        2.2AFB的浓度测定

        按照AFB,标准曲线的绘制方法叨(具体见1。2。3),绘制AFB1的标准曲线(图5)。由吸光值A10~A12,与A0的比值在标准曲线上求得对应的浓度对数值,求导数后得到待测溶液的浓度,最后得到待测溶液的平均浓度为3312ng/mL,即按响应面分析设计的方法提取的AFB,浓度为3312ng/mL。

       3讨论

        目前虽然已有针对相对湿度和温度建立的黄曲霉生长模型,SamapundoL等以5个温度梯度(16℃、22℃、25℃、30℃和37℃)和7个湿度梯度(0。801~0。982)为条件分别培养黄曲霉菌,运用二次方程函数分析发现30℃左右黄曲霉生长最迅速,并指出温度和湿度与黄曲霉菌的生长速度有很强的相关性。彭坚等发现黄曲霉生长的温度模型符合Rosso模型,并通过该预测模型发现在60%的相对湿度条件下,黄曲霉的最适生长温度为31。4℃1]。但这些研究并未考虑各相关培养条件组合下时间因子对菌斑直径变化的影响。
        本实验首次采用响应面模型研究方法系统研究了不同温度、湿度组合在不同时间点上对黄曲霉菌生长的影响。首先对实验进行必要的假设:进行孢子接种培养时,不考虑移液枪每枪打在培养基正中央的初始直径的差异,统一假设初始直径为1mm;假设椭圆菌斑的直径为椭圆长轴与短轴的平均值。然后采用统计学方法处理数据并进行显著性分析,最后采用响应面模型研究方法,系统体现了温度和湿度之间的相关性在不同时间点对黄曲霉菌生长的影响,获得了大米培养基条件下黄曲霉产毒的最优方案,即在35℃、100%湿度培养条件下,培养16~17d,黄曲霉菌产AFB,的平均浓度为3312ng/mL,而未经试验设计所提取出的AFB,的浓度为1101。471ng/mL]运用本方案单位面积AFB,产量是未经试验设计的3倍,本研究方法测得大米培养基中的AFB,含量至少为165。6ng/mL。
        本实验为进一步探讨在AFB1胁迫下,各种动物组织特别是肝脏组织中的蛋白质差异表达谱打下了基础,同时也发现了防止储藏大米受黄曲霉毒素污染的备选方案,即大米储藏条件应为:温度低于15℃,相对湿度低于90%。

相关产品:

相关阅读:

焦作云之羽生物科技有限公司

欢迎咨询QQ:2579524436

联系电话:18317267598

扫描右侧二维码添加微信

我们将竭诚为您提供让您满意的服务!

首页
电话
QQ