逆转录酶(reversetranscriptase)PERT荧光定量PCR检测试剂盒

主要用途

逆转录酶（reverse transcriptase）活性 PERT 荧光(SYBR GREEN)定量 PCR 检测试剂是一种旨在运用 SYBR绿色荧光染料作为标记信号，结合产物增强型逆转录酶（PERT）的 PCR 扩增，既方便、快速，又实时检测和定量分析扩增产物，即逆转录酶酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。广泛应用于临床病毒感染、生物制品，例如疫苗等病毒污染的监测。产品即到即用，性能稳定，无核酶污染，操作便捷，敏感高效，定量准确，重复性强。

技术背景

逆转录酶（REVERSE TRANSCRIPTASE；EC2.7.7.49），又称为 RNA 依赖性 DNA 聚合酶（RNA-dependentDNA polymerase），是将单链 RNA 分子转录为双链 DNA 的 DNA 聚合酶，包括 HIV 逆转录酶、莫洛尼氏鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus；MMLV）逆转录酶、禽类成髓细胞瘤病毒（avian myeloblastosisvirus；AMV）逆转录酶、端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase） 等。逆转录病毒使用逆转录酶达到逆转录 RNA 为 DNA，然后整合到宿主基因组再复制。在真核生物中，端粒酶是一种逆转录酶。逆转录酶在分子生物学中得到广泛运用。检测逆转录酶活性成为病毒感染或污染的监测手段，同时作为药物筛选的靶标。逆转录酶活性检测方法之一是以 PCR 为基础的产物增强型逆转录酶（product-enhanced reversetranscriptase；PERT）技术，采用噬菌体 MS2 RNA 为模板，设计引物。SYBR 绿色荧光染料，作为 DNA结合染料，进行定量 PCR 反应。根据每一循环的荧光强度来确定扩增产物的产量，并用循环阈值（thresholdcycle；Ct）表示。然后通过 AMV 逆转录酶标准曲线对待测样品进行活性定量分析。PERT 实时定量 PCR技术灵敏、特异、实时、可靠。

产品内容

稀释液（Reagent A）

转录液（Reagent B）

底物液（Reagent C）

补充液（Reagent D）

反应液（Reagent E）

染色液（Reagent F）

封隔液（Reagent G）

标准液（Reagent H）

产品说明书

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；染色液（Reagent F）避免光照，有效保证 6 月。

用户自备

1.5 毫升离心管：用于样品操作的容器

4℃微型台式离心机：用于样品操作2

PCR 管：用于样品扩增操作的容器

荧光定量 PCR 仪：用于荧光定量 PCR 反应

实验提示

一、 标准样品制备

1． 准备好 7 个无菌的 1.5 毫升离心管，标记为 1 至 7 号管

2． 按下表分别加入 xx 微升的稀释液（Reagent A）到 2 至 7 管

3． 移取 xx 微升标准液（Reagent H）到 1 号管

4． 小心移取 xx 微升 1 号管的标准液（Reagent H）到 2 号管，混匀

5． 小心移取 xx 微升 2 号管稀释的标准液（Reagent H）到 3 号管，混匀

6． 小心移取 xx 微升 3 号管稀释的标准液（Reagent H）到 4 号管，混匀

7． 以此类推

8． 将 1 至 7 号管放进冰槽里备用；标准管浓度见下表

二、 定量检测

1． 移取 xx 微升转录液（Reagent B）到 0.5 毫升 PCR 管

2． 加入 xx 微升上述制备的标准液（Reagent H）或待测样品（注意：选择 4 个标准品+空对照）

3． 加入 xx 微升底物液（Reagent C）

4． 加入 xx 微升补充液（Reagent D）到总量 20 微升

5． 放进 4℃微型台式离心机瞬时离心 5 秒

6． 在 42℃温度下孵育 30 分钟

7． 在 95℃温度下孵育 5 分钟

8． 置于冰槽里备用

9． 移取 xx 微升反应液（Reagent E）到 0.5 毫升 PCR 管

10．加入 2 微升上述冰槽里备用的转录产物

11．加入 xx 微升染色液（Reagent F）

12．加入 xx 微升补充液（Reagent D）到总量 25 微升

13．使用 1000 微升枪头加入 1 滴封隔液（Reagent G）（注意：参见注意事项 10）

14．即刻放进荧光定量 PCR 仪

15．荧光定量 PCR 反应程序为（选择 FAM 染料）：

温度（℃）        时间        循环

95                                                5 秒                                   45

60                                               30 秒

72                                   15 秒

16．采集数据，进行扩增曲线分析（退火温度进行荧光信号采集）

17．构建 AMV 逆转录酶活性标准曲线：纵座标（Y 轴）为 Ct 值；横座标（X 轴）为标准 AMVRT 活性对数（单位/微升）

18．根据标准曲线获得样品对应逆转录酶活性（单位/微升）

注意事项

1． 本产品为 20 次 PCR 反应

2． 本产品检测敏感度达 10 -8单位/微升

3． 操作时，须戴手套

4． 本产品适合各种荧光定量 PCR 仪

5． 建议整个操作在 4℃下进行

6． 必须使用带滤芯的枪头

7． 所有器皿、离心管、液体等无 RNA 酶污染

8． 使用时，避免污染母液

9． 用户根据实际情况，选择 4 至 5 管标准区间范围

10．根据用户 PCR 仪的性能，决定是否加入封隔液（Reagent G）

11．配制完成后，即刻进行扩增反应，以确保反应物的活性

12．试剂避免反复冻融

13．PCR 扩增反应的最初 3 个循环为定量基线；3 至 15 个循环的荧光信号的 10 倍值为荧光阈值；荧光信号达到阈值所需的循环数为 Ct 值；建议使用 Log ΔRn 相对定量参数（参考图像如下）：参考随货说明书。

14．通常 10 3至 10 4皮单位（pU）逆转录酶等于 1 至 10 个病毒粒子（virion）

15．通常 10 3皮单位（pU）逆转录酶等于 70 至 80 逆转录酶分子

16．本公司提供系列逆转录酶活性检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定无核酶污染

3． 本产品经鉴定反应灵敏

使用承诺

用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后 10 天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

说明书下载

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更新时间：2020-12-15 12:00:55    作者：云之羽生物     点击：663次