人体hMLH1基因甲基化检测试剂盒说明书

主要用途

人体 hMLH1 基因甲基化检测试剂是一种旨在通过化学方法使基因组中的所有胞嘧啶（CYTOSINE）转变成尿嘧啶（URACIL），而保留了所有甲基化的胞嘧啶，经过甲基化特异性 PCR 扩增，探测到人体错配修复基因 hMLH1 启动子 CpG 岛甲基化信息的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。可以被用于人体错配修复基因 hMLH1 相关的肿瘤表观遗传学研究。产品即到即用，性能稳定，操作简便，转化保证。

技术背景

在基因的启动子区域（promotor region）通常存在一些富含重复双核苷酸“”的区域，称为“岛”（ island）。在人类基因组内，存在有近 3 万个岛。这些岛不仅是基因的一种标志，而且还参与基因表达的调控和影响染色质的结构，更是 DNA 甲基化的唯一位置。岛甲基化形态的扫描分析是基因表达和表观基因组学的主要课题。位于细胞核内的 hMLH1（human mutL homolog1）是人体错配修复基因，与细菌 MutL 基因同源。其由 19 个外显子， 碱基组成，编码区域 碱基，编码 氨基酸， 。hMLH1 基因包含三个结构域： 。其主要作用在于参与 DNA 复制后的错配基因的修复操作。一旦突变或甲基化，会造成基因组微卫星不稳定以及错配修复机制缺失，而致肿瘤等。

产品内容

缓冲液（Reagent A）、变性液（Reagent B）、处理液（Reagent C）、转化液（Reagent D）、封隔液（Reagent E）、净化液（Reagent F）、萃取液（Reagent G）、浓缩液（Reagent H）、助沉液（Reagent I）、沉淀液（Reagent J）、清理液（Reagent K）、保存液（Reagent L）、扩增液（Reagent M）、补充液（Reagent N）、U 引物 F（Reagent O）、U 引物 R（Reagent P）、M 引物 F（Reagent Q）、M 引物 R（Reagent R）、针筒离心柱、产品说明书。

保存方式

保存处理液（Reagent C）、转化液（Reagent D）、助沉液（Reagent I）、扩增液（Reagent M）、补充液（ReagentN）、 U 引物 F（Reagent O）、 U 引物 R（Reagent P）、 M 引物 F（Reagent Q）和 M 引物 R（Reagent R）在－20℃冰箱里；净化液（Reagent F）和针筒离心柱保存在室温下；其余的保存在 4℃冰箱里；处理液（ReagentC）和转化液（Reagent D）避免光照；有效保证 6 个月。

用户自备

1.5 毫升离心管：用于样品操作的容器

2.0 毫升离心管：用于样品操作的容器

恒温水槽：用于孵育反应物

微型台式离心机：用于沉淀样品或去除杂质

涡旋震荡仪：用于混匀反应物

真空泵：用于去除样品中的液体成分

针筒挤压塞：用于去除样品中的液体成分

PCR 仪：用于样品扩增

PCR 管或平板：用于 PCR 反应的容器

测序试剂盒：用于测序前的产物处理

实验步骤

实验开始前，将处理液（Reagent C）和转化液（Reagent D）从－20℃冰箱中取出，置入室温下。同时将其中一管缓冲液（Reagent A）置入 65℃恒温水槽中预热备用。然后进行下列操作：

一、 转化实验

1． 准备 1 个 2.0 毫升离心管

2． 加入 2 微克 DNA 样品

3． 加入适量的缓冲液（Reagent A）到 50 微升反应体系（注意：不要使用 65℃预热的缓冲液（Reagent A））

4． 加入 xx 微升变性液（Reagent B），混匀

5． 放进 37℃恒温水槽孵育 12 分钟

6． 加入 xx 微升处理液（Reagent C）（注意：可见溶液呈现黄色）

7． 在涡旋震荡仪上小心震荡 30 秒，充分混匀

8． 加入 xx 微升转化液（Reagent D），上下倾倒混匀

9． 加入 xx 微升封隔液（Reagent E）

10．放进 55℃恒温水槽孵育 16 小时

11．小心抽去 xx 微升封隔液（Reagent E）

12．加入 xx 毫升充分摇匀的净化液（Reagent F），上下倾倒混匀

13．移入到针筒离心柱

14．连接到真空泵，将柱内液体抽去（或使用用户自备的针筒挤压塞挤去柱内液体）

15．加入 xx 毫升萃取液（Reagent G）

16．运用真空泵，将萃取液（Reagent G）抽去（或使用用户自备的针筒挤压塞挤去柱内液体）

17．重复实验步骤 15 至 16 一次

18．去掉针筒，将离心柱放在 1.5 毫升离心管

19．放进微型台式离心机离心 20 秒，速度为 16000g（或 13000RPM；例如 eppendorf 5415）

20．加入 xx 微升 65℃预热的缓冲液（Reagent A）到离心柱

21．室温下静置 1 分钟

22．放进微型台式离心机离心 20 秒，速度为 16000g（或 13000RPM；例如 eppendorf 5415）

23．去掉离心柱

24．加入 xx 微升变性液（Reagent B）到离心管，混匀

25．放进 37℃恒温水槽孵育 12 分钟

26．加入 xx 微升浓缩液（Reagent H）

27．加入 xx 微升助沉液（Reagent I）

28．加入 xx 微升沉淀液（Reagent J）

29．在涡旋震荡仪上强烈震荡 30 秒

30．放进微型台式离心机离心 15 分钟，速度为 16000g（或 13000RPM；例如 eppendorf 5415）

31．小心抽掉上清液

32．加入 xx 毫升清理液（Reagent K）

33．放进微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 16000g（或 13000RPM；例如 eppendorf 5415）

34．小心抽掉上清液

35．空气中晾干沉淀颗粒群

36．加入 xx 微升保存液（Reagent L）

37．放进－20℃冰箱长期保存

二、甲基化特异性 PCR

1． 将扩增液（Reagent M）、补充液（Reagent N）、 U 引物 F（Reagent O）、 U 引物 R（Reagent P）、 M引物 F（Reagent Q）和 M 引物 R（Reagent R）从－20℃冰箱里取出

2． 置入冰槽里直至融化

3． 针对一个样本，准备 2 个 PCR 管，分别标记为 U 和 M 管

4． 分别移出 xx 微升扩增液（Reagent M）到 PCR 管里

5． 分别加入 1 微升上述转化实验中获得的 DNA 样品（总量 100 纳克）

6． 分别加入 xx 微升 U 引物 F（Reagent O）和 U 引物 R（Reagent P）到 U 管中

7． 分别加入 xx 微升 M 引物 F（Reagent Q）和 M 引物 R（Reagent R）到 M 管中

8． 再分别加入 xx 微升补充液（Reagent N）（反应总量为 25 微升）

9． 即刻放进微型台式离心机瞬时离心 5 秒，速度为 500g（或 2000RPM；例如 eppendorf 5415）

10．加入 50 微升 PCR 级矿物油（注意：参见注意事项 9）

11．即刻进行热启动 PCR 反应：

12．反应完毕后，移取 5 微升进行 1.8%琼脂糖凝胶电泳

13．阳性条带：转化后非甲基型（U）――124 bp；转化后甲基型（M）――153 bp

注意事项

1． 本产品为 20 次操作

2． 操作时，须戴手套

3． 建议使用带滤芯的枪头，避免污染

4． 一个特定基因的甲基化特异性 PCR 通常包括：

5． 甲基化特异性 PCR 的引物设计原则：4

6． U 引物 F（Reagent O）、 U 引物 R（Reagent P）、 M 引物 F（Reagent Q）和 M 引物 R（Reagent R）的信息如下：

7． 通过琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测 PCR 扩增后的结果。假如 DNA 样品在修饰前是未甲基

化的，那么仅仅“U”Primers 将产生扩增产物；相反，已甲基化的 DNA 样品仅仅用“M”Primer 能被扩增

8． 组织样品或杂合子样品常常出现“U”和“M”同时呈现阳性；建议使用基因甲基化程度定量分析试剂盒

（20024.3）予以分析

9． 根据用户 PCR 仪的性能，决定是否加入矿物油（Mineral Oil）

10．必要时，可以调整 Tm 温度

11．在－20℃冰箱里储存的产品避免反复冻融

12．转化后的 DNA 保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融

13．本公司同时提供数字化表观基因组完全分析（全部甲基化基因）技术试剂盒和外包服务（90002）

14．本公司同时提供系列基因甲基化分析试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定转化保证

3． 本产品经鉴定无核酶污染

4． 本产品经鉴定反应产量高

使用承诺

用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后 10 天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

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