MGMT基因甲基化程度定量分析试剂盒说明书

主要用途

人体 MGMT 基因甲基化程度定量分析试剂是一种旨在通过化学方法使基因组中的所有胞嘧啶（CYTOSINE）转变成尿嘧啶（URACIL），而保留了所有甲基化的胞嘧啶，进而运用 SYBR 绿色荧光染料作为标记信号，进行各种甲基化 DNA 模板的特异性扩增，定量分析扩增产物，获得人体肿瘤抑制基因MGMT 启动子 CpG 岛甲基化程度的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。可以被用于人体恶性胶质瘤的治疗研究。产品即到即用，性能稳定，操作简便，转化保证。

技术背景

在基因的启动子区域（promotor region）通常存在一些富含重复双核苷酸“CG”的区域，称为“CpG 岛”（CpGisland）。在人类基因组内，存在有近 3 万个 CpG 岛。这些 CpG 岛不仅是基因的一种标志，而且还参与基因表达的调控和影响染色质的结构，更是 DNA 甲基化的唯一位置。CpG 岛甲基化形态的扫描分析是基因表 达 和 表 观 基 因 组 学 的 主 要 课 题 。 O6- 甲 基 鸟 嘌 呤 -DNA 甲 基 转 移 酶（O6-methylguanine-DNAmethyltransferase；MGMT；EC2.1.1.63），又称为烷基鸟嘌呤-DNA 烷基转移酶（O6-alkylguanine DNA alkyltransferase ；AGT 或 AGAT），为 DNA 修复酶，对基因组的稳定具有关键作用，包括基因突变损伤的修复，防止 DNA 复制和转录方面的错配。MGMT 的丢失将增加烷基化化学品的致癌风险，包括宫颈癌、肠道癌等。其中烷基化化学品会导致烷基化鸟嘌呤（O6-alkylguanine）的形成，更容易导致肿瘤的发生。 临床证明 MGMT 的甲基化会导致恶性胶质瘤（Glioblastoma），因此 MGMT 甲基化程度定量检测用于预测恶性胶质瘤的预后和药物个性化的选择。

产品内容

反应液（Reagent A）  

分层液（Reagent B）

缓冲液（Reagent C）

变性液（Reagent D）

处理液（Reagent E）

转化液（Reagent F）

封隔液（Reagent G）

净化液（Reagent H）

萃取液（Reagent I）

浓缩液（Reagent J）

助沉液（Reagent K）

沉淀液（Reagent L）

清理液（Reagent M）

保存液（Reagent N）

扩增液（Reagent O）

染色液（Reagent P）

补充液（Reagent Q）

MYOD 引物液（Reagent R）

MGMT 引物液（Reagent S）

针筒离心柱

产品说明书

保存方式

保存反应液（Reagent A）、分层液（Reagent B）、处理液（Reagent E）、转化液（Reagent F）、助沉液（ReagentK）、扩增液（Reagent O）、染色液（Reagent P）、 MYOD 引物液（Reagent R）、 MGMT 引物液（ReagentS）在－20℃冰箱里；净化液（Reagent H）和针筒离心柱保存在室温下；其余的保存在 4℃冰箱里；处理液（Reagent E）和转化液（Reagent F）避免光照；有效保证 6 月。

用户自备

1.5 毫升离心管：用于样品操作的容器

2.0 毫升离心管：用于样品操作的容器

恒温水槽：用于孵育反应物

微型台式离心机：用于沉淀样品或去除杂质

涡旋震荡仪：用于混匀反应物

真空泵：用于去除样品中的液体成分

针筒挤压塞：用于去除样品中的液体成分

荧光定量 PCR 仪：用于荧光定量 PCR 反应

PCR 管或平板：用于 PCR 反应的容器

实验步骤

一、 对照样品完全甲基化实验

1． 取出 1 管反应液（Reagent A），置于冰槽里融化

2． 加入 20 微升（总量 2 微克对照 DNA 样品），混匀

3． 放进 37℃恒温水槽孵育 60 分钟

4． 转移到 65℃恒温水槽孵育 15 分钟

5． 加入 xx 微升 GNEMED 分层液（Reagent B）

6． 强力涡旋震荡 15 秒

7． 放进微型台式离心机离心 10 分钟，速度为 16000g

8． 小心移取 200 微升上层液相到新的 1.5 毫升离心管

9． 加入 xx 微升浓缩液（Reagent J）

10．加入 xx 微升助沉液（Reagent K）

11．加入 xx 微升沉淀液（Reagent L）

12．涡旋震荡 15 秒

13．放进微型台式离心机离心 15 分钟，速度为 16000g

14．小心抽去上清液

15．加入 xx 毫升清理液（Reagent M）

16．放进微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 16000g

17．小心抽掉上清液

18．加入 xx 微升缓冲液（Reagent C），混匀后，标记为对照完全甲基化样品19．继续后续转化实验步骤 4 开始

二、 转化实验

实验开始前，将处理液（Reagent E）和转化液（Reagent F）从－20℃冰箱中取出，置入室温下。同时将其中一管缓冲液（Reagent C）置入 65℃恒温水槽中预热备用。然后进行下列操作：

1． 准备 1 个 2.0 毫升离心管

2． 加入 2 微克待测 DNA 样品

3． 加入适量的缓冲液（Reagent C）到 50 微升反应体系（注意：不要使用 65℃预热的缓冲液（Reagent C））

4． 加入 xx 微升变性液（Reagent D），混匀

5． 放进 37℃恒温水槽孵育 12 分钟

6． 加入 xx 微升处理液（Reagent E）（注意：可见溶液呈现黄色）

7． 在涡旋震荡仪上小心震荡 30 秒，充分混匀

8． 加入 xx 微升转化液（Reagent F），上下倾倒混匀

9． 加入 xx 微升封隔液（Reagent G）

10．放进 55℃恒温水槽孵育 16 小时

11．小心抽去 xx 微升封隔液（Reagent G）

12．加入 xx 毫升充分摇匀的净化液（Reagent H），上下倾倒混匀（注意：净化液（Reagent H）出现沉淀，37℃温育后使用）

13．移入到针筒离心柱

14．连接到真空泵，将柱内液体抽去（或使用用户自备的针筒挤压塞挤去柱内液体）

15．加入 xx 毫升萃取液（Reagent I）

16．运用真空泵，将萃取液（Reagent I）抽去（或使用用户自备的针筒挤压塞挤去柱内液体）

17．重复实验步骤 15 至 16 一次

18．去掉针筒，将离心柱放在 1.5 毫升离心管

19．放进微型台式离心机离心 30 秒，速度为 16000g

20．去掉残余萃取液，更换新的 1.5 毫升离心管

21．加入 xx 微升 65℃预热的缓冲液（Reagent C）到离心柱

22．室温下静置 1 分钟

23．放进微型台式离心机离心 30 秒，速度为 16000g

24．去掉离心柱

25．加入 xx 微升变性液（Reagent D）到离心管，混匀

26．放进 37℃恒温水槽孵育 12 分钟

27．加入 xx 微升浓缩液（Reagent J）

28．加入 xx 微升助沉液（Reagent K）

29．加入 xx 微升沉淀液（Reagent L）

30．在涡旋震荡仪上震荡 30 秒

31．放进微型台式离心机离心 15 分钟，速度为 16000g

32．小心抽掉上清液

33．加入 xx 毫升清理液（Reagent M）

34．放进微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 16000g（或 13000RPM；例如 eppendorf 5415）

35．小心抽掉上清液

36．空气中晾干沉淀颗粒群

37．加入 xx 微升保存液（Reagent N）

38．放进－20℃冰箱长期保存

三、甲基化特异性定量 PCR

1． 一次反应总量为 25 微升

2． 分别移取 xx 微升扩增液（Reagent O）到 4 个 0.5 毫升 PCR 管，并做好标记：对照完全 MGMT 管、对照完全 MYOD 管、样品 MGMT 管和样品 MYOD 管

3． 分别加入 1 微升上述转化实验中获得的对照完全 DNA 样品到对照完全 MGMT 管和对照完全 MYOD管里（各总量 100 纳克）

4． 分别加入 1 微升上述转化实验中获得的待测 DNA 样品到样品 MGMT 管和样品 MYOD 管里（各总量100 纳克）

5． 分别加入 xx 微升 MYOD 引物液（Reagent R）到对照完全 MYOD 管和样品 MYOD 管里

6． 分别加入 xx 微升 MGMT 引物液（Reagent S）到对照完全 MGMT 管和样品 MGMT 管里

7． 分别加入 xx 微升染色液（Reagent P）到所有管里

8． 分别加入 xx 微升补充液（Reagent Q）到所有管里（总量 25 微升）

9． 放进 4℃微型台式离心机瞬时离心 5 秒

10．加入 50 微升用户自备的 PCR 级矿物油（注意：参见注意事项 7）

11．即刻放进荧光定量 PCR 仪

12．荧光定量 PCR 反应程序为：

13．采集数据，获得 Ct 值

三、甲基化百分比计算

       计算公式参考随货纸质版说明书。

注意事项

1． 本产品为 20 次操作

2． 操作时，须戴手套

3． 建议使用带滤芯的枪头，避免污染

4． 对照样品完全甲基化实验只需操作一次

5． 本产品适合各种荧光定量 PCR 仪

6． 对照完全 MGMT）和对照完全 MYOD 定量扩增只需操作一次

7． 根据用户荧光 PCR 仪的性能，决定是否加入矿物油（Mineral Oil）

8． 必要时，可以调整 Tm 温度

9． 试剂避免反复冻融

10．转化后的 DNA 保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融

11． MYOD 引物液（Reagent R）为肌原性分化抗原基因（myogenic differentiation antigen；MYOD） ，作为内参基因以校正（normalization）目标基因

12．配制完成后，即刻进行扩增反应，以确保反应物的活性

13．PCR 扩增反应的最初 3 个循环为定量基线；3 至 15 个循环的荧光信号的 10 倍值为荧光阈值；荧光信号达到阈值所需的循环数为 Ct 值

14．Ct 参考值：完全甲基化的 Ct 值通常为 20 左右；样本甲基化的 Ct 值为 25 至 35 左右；甲基化阴性的Ct 值大于 40；背景值 Ct 大于 45

15．甲基化水平/程度/密度参考范围：小于 1%为背景值；小于 4 至 10 为正常水平；大于 10%为异常水平；大于 30%为高度甲基化水平。但不同的基因不尽相同。有时甲基化水平大于 100%

16．用户可以根据样本群确定甲基化水平的正常和异常值

17．本公司提供系列甲基化分析试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定转化保证

3． 本产品经鉴定无核酶污染

4． 本产品经鉴定反应产量高

使用承诺

用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后 10 天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

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