粘着斑蛋白(vinculin)荧光染色试剂盒说明书
发布时间：2023-12-15 10:56:05作者：云之羽来源：云之羽点击：86 次
主要用途
粘着斑蛋白（vinculin）荧光染色试剂是一种旨在运用抗粘着斑蛋白单克隆抗体以及荧光染料缀合物二抗，通过荧光显微镜分析粘附斑状况的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。主要适用于各种活体细胞（大鼠、小鼠、人体、鸟类等）的膜结构粘附斑分析。产品严格无菌，即到即用，反应敏感，操作简捷，性能稳定，荧光清晰。
技术背景
粘着斑蛋白（vinculin）是一种细胞骨架蛋白，与细胞和细胞之间、细胞和细胞外基质粘附接合点（adherence junction）相关。粘着斑蛋白和F-肌动蛋白反应，以及踝蛋白（talin）α和辅肌动蛋白（α-actinin） 等形成复合物，停靠在质膜上，构成跨膜粘附斑（focal contact）的装配，同时成为信号传导的位点。
产品内容
清理液（Reagent A） 20毫升
固着液（Reagent B） 25毫升
封阻液（Reagent C） 2毫升
抗体液（Reagent D） 1毫升
染色液（Reagent E） 1毫升
复染液（Reagent F） 1毫升
抗淬灭液（Reagent G） 500微升
产品说明书 1份
保存方式
保存固着液（Reagent B）、封阻液（Reagent C）、抗体液（Reagent D）、染色液（Reagent E）、复染液（Reagent F）和抗淬灭液（Reagent G）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；抗体液（Reagent D）和染色液（Reagent E）严禁反复冻融；染色液（Reagent E）、复染液（Reagent F）和抗淬灭液（Reagent G）避免光照；有效保证6月
用户自备
盖玻片：用于封片孵育
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于细胞脱离
完全细胞培养液（GMS12052）：用于中和胰蛋白酶的处理
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
台式离心机：用于样品操作
培养箱：用于细胞染色孵育
荧光（共聚焦）显微镜：用于细胞荧光观察
实验步骤
方法一：载玻片贴壁细胞检测
实验开始前，将－20℃冰箱里试剂盒中的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作：
1． 准备1个载玻片的细胞样品
2． 加上200微升清理液（Reagent A），铺满样品表面
3． 小心抽去清理液（Reagent A）
4． 加上500微升－20℃预冷的固着液（Reagent B）
5． 置于－20℃冰箱里孵育20分钟
6． 小心抽去固着液（Reagent B）
7． 空气中晾干
8． 加上200微升清理液（Reagent A），铺满载玻片样品表面
9． 室温下孵育2分钟
10． 小心抽去清理液（Reagent A）
11． 加上200微升封阻液（Reagent C），铺满载玻片样品表面
12． 置于37℃培养箱里孵育30分钟，保持湿润
13． 小心抽去封阻液（Reagent C）
14． 加上100微升抗体液（Reagent D），铺满载玻片样品表面
15． 盖上盖玻片，置于37℃培养箱里孵育30分钟（注意：避免气泡）
16． 小心移去盖玻片，抽去抗体液（Reagent D）
17． 加上200微升清理液（Reagent A），铺满载玻片样品表面
18． 置于37℃培养箱里孵育5分钟，保持湿润
19． 小心抽去清理液（Reagent A）
20． 重复实验步17至19二次
21． 加上100微升染色液（Reagent E），铺满载玻片样品表面
22． 盖上新的盖玻片，置于37℃培养箱里孵育30分钟，避免光照（注意：避免气泡）
23． 小心移去盖玻片，抽去染色液（Reagent E）
24． 加上200微升清理液（Reagent A），铺满载玻片样品表面
25． 置于37℃培养箱里孵育5分钟，保持湿润
26． 小心抽去清理液（Reagent A）
27． 重复实验步24至26二次
28． 加上100微升复染液（Reagent F），铺满载玻片样品表面
29． 室温下孵育3分钟，避免光照
30． 小心抽去复染液（Reagent F）
31． 加上50微升抗淬灭液（Reagent G）
32． 盖上盖玻片或封片
33． 即刻在荧光显微镜下观察
染色液（Reagent E） | 复染液（Reagent F） | |
荧光染料 | 异硫氰酸荧光素（FITC） | 二咪基联苯基吲哚（DAPI） |
荧光颜色 | 绿色 | 蓝色 |
激发波长 | 488 | 350 |
散发波长 | 530 | 460 |
作用 | 粘着斑蛋白显示 | 核显示 |
方法二：悬浮细胞涂片检测
实验开始前，将－20℃冰箱里试剂盒中的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作：
1． 准备1个60 mm细胞培养皿的细胞（2 X 106细胞）
2． 直至细胞铺满率达到50％
3． 小心抽去细胞培养液
4． 加入2毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液
5． 放进37℃细胞培养箱孵育1分钟
6． 加入3毫升用户自备的完全细胞培养液
7． 移取细胞悬液到15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
8． 放进台式离心机离心10分钟，速度为400g（或1500rpm，例如EPPENDORF 5810R）
9． 小心抽去上清液
10． 加入1毫升－20℃预冷的固着液（Reagent B），混匀细胞颗粒群
11． 放进台式离心机离心10分钟，速度为400g（或1500rpm，例如EPPENDORF 5810R）
12． 小心抽去固着液（Reagent B）
13． 重复实验步骤10至12一次
14． 加入200微升固着液（Reagent B），混匀细胞颗粒群（注意：可以长期保存在－20℃冰箱里）
15． （选择步骤）细胞计数（使用固着液（Reagent B）调整细胞到1 X 107细胞/毫升）
16． 滴上10微升细胞悬液在载波片上，然后推片
17． 室温下静置10分钟，或直至空气中晾干载玻片 （注意：可以保存在70％酒精里，放进4℃冰箱长达数月）
18． 加上200微升清理液（Reagent A），铺满载玻片样品表面
19． 室温下孵育2分钟
20． 小心抽去清理液（Reagent A）
21． 加上200微升封阻液（Reagent C），铺满载玻片样品表面
22． 置于37℃培养箱里孵育30分钟，保持湿润
23． 小心抽去封阻液（Reagent C）
24． 加上100微升抗体液（Reagent D），铺满载玻片样品表面
25． 盖上盖玻片，置于37℃培养箱里孵育30分钟（注意：避免气泡）
26． 小心移去盖玻片，抽去抗体液（Reagent D）
27． 加上200微升清理液（Reagent A），铺满载玻片样品表面
28． 置于37℃培养箱里孵育5分钟，保持湿润
29． 小心抽去清理液（Reagent A）
30． 重复实验步27至29二次
31． 加上100微升染色液（Reagent E），铺满载玻片样品表面
32． 盖上新的盖玻片，置于37℃培养箱里孵育30分钟，避免光照（注意：避免气泡）
33． 小心移去盖玻片，抽去染色液（Reagent E）
34． 加上200微升清理液（Reagent A），铺满载玻片样品表面
35． 置于37℃培养箱里孵育5分钟，保持湿润
36． 小心抽去清理液（Reagent A）
37． 重复实验步34至36二次
38． 加上100微升复染液（Reagent F），铺满载玻片样品表面
39． 室温下孵育3分钟，避免光照
40． 小心抽去复染液（Reagent F）
41． 加入50微升抗淬灭液（Reagent G）
42． 盖上盖玻片或封片
43． 即刻在荧光显微镜下观察
染色液（Reagent E） | 复染液（Reagent F） | |
荧光染料 | 异硫氰酸荧光素（FITC） | 二咪基联苯基吲哚（DAPI） |
荧光颜色 | 绿色 | 蓝色 |
激发波长 | 488 | 350 |
散发波长 | 530 | 460 |
作用 | 粘着斑蛋白显示 | 核显示 |
注意事项
1． 本产品为10次操作量
2． 在整个操作过程中须戴手套，以防污染
3． 孵育时，须避免光照
4． 载玻片必须非常洁净，且要冷冻后使用
5． 建议细胞染色完成后，即刻进行荧光显微镜观察。如果放进4℃冰箱里待测，不要超过3天
6． 本公司提供系列细胞骨架检测试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定荧光清晰
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