酵母氢ATP酶(H＋－ATPase)活性比色法定量检测试剂盒

主要用途

酵母氢 ATP 酶（H ＋ -ATPase）活性酶连续反应光谱法定量检测试剂是一种旨在使用氢 ATP 酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，在排除其它 ATP 酶干扰的情况下，受到氢 ATP 酶的水解产生的 ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光谱法测定其氧化后吸光峰值（NADH 浓度）的变化，以此进行测算单位酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种酵母细胞 H ＋ -ATP 酶的特异性活性检测。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景

氢ATP 酶（H ＋ -ATPase；EC3.6.3.14），又称为质子或氢离子转位 ATP 酶（Proton-Translocating ATPases），在生物能量传导过程中起着重要作用。其分成三类：质膜型（plasma membrane type）、真细菌型（eubacterialtype）和液泡型（vacuolar type）。质膜型存在于植物、酵母和胃酸分泌型囊泡的质膜上；真细菌型存在于叶绿体、线粒体和细菌上，由疏水的膜部分和亲水的催化部分组成；液泡型存在于真核生物细胞器的液泡系统。在酵母细胞中，质膜型氢 ATP 酶，约 100kd 蛋白，的重要性在于调节细胞内 pH 水平和内环境稳定；液泡型氢 ATP 酶是 V 型 ATP 酶的主要成员，一种异源性寡聚体大复合物，使细胞内液泡酸性化，维持细胞内化学渗透压动态平衡。氢 ATP 酶催化三磷酸腺苷分解为二磷酸腺苷和无机磷。这一去磷酸化反应释放出能量，成为细胞生命代谢的能源。同时利用细胞内 ATP 释放的能量逆向跨质膜把质子转运出细胞，产生并保持细胞膜两侧 H 的电化学梯度，为一系列次级转运体和通道蛋白对各种营养物质及离子的跨质膜转运提供能量。基于 ATP，在排除其它，包括钙（EGTA 处理）、钠钾（乌本苷；ouabain 处理）等 ATP 酶的干扰下，受到氢 ATP 酶的水解，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的变化（340nm），来定量分析氢 ATP 酶的特异活性。其反应系统为：

产品内容

裂解液（Reagent A）

强化液（Reagent B）

缓冲液（Reagent C）

酶促液（Reagent D）

反应液（Reagent E）

底物液（Reagent F）

阴性液（Reagent G）

产品说明书

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；底物液（Reagent F），避免光照，有效保证 6 月。

用户自备

15 毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

1.5 毫升离心管：用于样品操作和保存的容器

（微型）台式离心机：用于样品操作

恒温摇床：用于酵母细胞培养

培养箱：用于反应孵育

比色皿：用于光谱分析的容器

分光光度仪：用于光谱分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；底物液（Reagent F）注意避光。然后进行下列操作。

一、 样品准备

1． 准备好 10 毫升待测的新鲜真菌/酵母细胞（OD600＝0.4 至 0.8，即 1 至 2 X 10 7 细胞/毫升）

2． 移入到预冷的 15 毫升锥形离心管

3． 置于冰槽里 5 分钟

4． 放进 4℃台式离心机离心 5 分钟，速度为 1000g

5． 小心抽去上清液

6． 加入 xx 微升裂解液（Reagent A），充分混匀

7． 转移到预冷的 1.5 毫升离心管

8． 加入 xx 微升强化液（Reagent B）

9． 强力涡旋震荡 15 秒

10．置于冰槽里 1 分钟

11．重复实验步骤 9 至 10 五次

12．加入 xx 微升裂解液（Reagent A），充分混匀

13．放进 4℃微型台式离心机离心 15 分钟，速度为 16000g（或 13000RPM，例如 eppendorf 5415）

14．小心移取 500 微升上清液到新的预冷的 1.5 毫升离心管

15．移取 10 微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

16．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测定准备

1． 准备好待测样品（例如纯化酵母细胞蛋白等），置于冰槽里

2． 设定好分光光度仪（温度为 28℃）：波长为 340nm，间隔 5 分钟，读数 7 次（共 30 分钟），并置零

3． 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、 背景对照测定

1． 移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

22． 加入 xx 微升酶促液（Reagent D）

3． 加入 xx 微升反应液（Reagent E）

4． 加入 xx 微升底物液（Reagent F）

5． 放进 28℃培养箱里静置 3 分钟

6． 加入 xx 微升阴性液（Reagent G）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340 波长读数 0 分钟 －340 波长读数 30 分钟

四、 样品活性测定

1． 移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升酶促液（Reagent D）

3． 加入 xx 微升反应液（Reagent E）

4． 加入 xx 微升底物液（Reagent F）

5． 放进 28℃培养箱里静置 3 分钟

6． 加入 50 微升待测样品（注意：50 微克蛋白；样品须溶解）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340 波长读数 0 分钟 －340 波长读数 30 分钟

五、 计算样品活性

 计算公式参考纸质版说明书

注意事项

1． 本产品为 21 次操作，包括背景对照测定

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，背景测定只需 1 次

4． 建议样品忌用磷酸缓冲溶液、钠盐、钾盐、镁盐、EDTA、EGTA 等，可以使用 SUCROSE、IMIDAZOLE等

5． 用户如果检测质膜型氢 ATP 酶活性，建议使用真菌/酵母细胞膜蛋白（本公司提供可溶性真菌/酵母细胞膜蛋白粗提制备试剂盒 30043.1）

6． 用户如果检测液泡型氢 ATP 酶活性，建议使用真菌/酵母细胞液泡蛋白（本公司提供真菌/酵母膜性囊泡（RSOV 和 IOV）制备试剂盒 10169.3）

7． 强化液（Reagent B）为固体状，移取方法为：使用 1 毫升枪头，将尖端部分剪去；或使用 0.5 毫升 PCR管的盖子内圈盛满；或秤重 0.1 克

8． 加入样品启动反应后 3 秒内即刻光谱测定

9． 反应测定值由高到低变化；测定可以持续 30 分钟

10．测定值由高到低变化，即 0 分钟测定读数高于 10 分钟或 30 分钟测定读数，表明有酶活性

11．光谱测定后，比色皿须清洗彻底

12．建议待测样本蛋白浓度为 50 微克/50 微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；注意计算公式的调整（本公司提供 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒 30030.1）

13．样品特异活性是指排除其它，包括钙（EGTA 处理）、钠钾（乌本苷；ouabain 处理）等 ATP 酶的干扰后的氢 ATP 酶活性

14．氢 ATP 酶活性单位浓度定义：在 28℃温度下，pH 7.5 条件下，每分钟内能够氧化 1 微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位

15．本公司提供系列 ATP 酶类分析技术产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测准确

使用承诺

用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后 10 天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

说明书下载

如需要【酵母氢ATP酶(H＋－ATPase)活性比色法定量检测试剂盒】电子版说明书及相关资料，请联系客服索取！

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更新时间：2020-12-15 12:00:49    作者：羽哚生物     点击：619次