动物组织氢/钾ATP酶(H＋/K＋－ATPase)活性比色法定量检测试剂盒

主要用途

动物组织氢/钾 ATP 酶（H ＋ /K ＋ -ATPase）活性酶连续反应光度法定量检测试剂是一种旨在使用氢/钾 ATP 酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，通过排除钠钾 ATP 酶、钙 ATP 酶、F 型 ATP 酶以及氢 ATP酶干扰的前提下，测定 ATP 水解产生的 ADP 过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光度法测定其氧化后峰值的变化，以此进行测算单位酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种动物组织裂解悬液，以及质膜、微粒体等氢/钾 ATP酶的特异活性检测，尤其是胃氢/钾 ATP 酶。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景

腺苷三磷酸酶，又称为ATP酶（adenosine triphosphatase；ATPase或ATP phosphohydrolase；EC3.6.1.3），属于磷酸水解酶，可以催化含磷的酸酐分解，即催化三磷酸腺苷分解为二磷酸腺苷和无机磷。ATP酶的去磷酸化反应释放出能量，成为细胞生命代谢的能源。ATP酶为跨膜蛋白（transmembrane），帮助传输各种代谢分子进出细胞。根据ATP酶的结构和功能，分为五类不同的ATP酶，即F、V、A、P和E型。F型，又称为F1F0型，主要在线粒体、叶绿体或细菌细胞膜上，进行氧化磷酸化或光合作用；P型，又称为E1E2 型，存在于细菌和真核细胞膜和细胞器上，其功能在于水解ATP获得能量，跨膜运输各种化学分子，包括Ca 2+传输性、Na + -K+ /H+ -K+传输性、H+传输性和所有细菌型等，其中胃氢/钾ATP酶，一种与胃酸分泌相关的质子泵，属于这一类型。V型，又称为V1V0型，主要存在于真核细胞的液泡（vacuole）中。A型，又称为A1A0型，存在于古生菌（archaea）中。E型，为细胞表面的酶。氢/钾ATP酶（EC 3.6.1.36）包括胃性、非胃性等，位于静止期胃细胞近顶点的微管泡膜上。其由异源双体构成，包括110KD的α亚体和55-600KD的β亚体，α亚体与催化和离子转运有关，β亚体与稳定结构和目标通道有关，达到氢钾离子交换。基于底物ATP，通过排除钠钾ATP酶（乌本苷；ouabain）、钙ATP酶（EGTA）、F型ATP酶（寡霉素；oligomycin）以及氢ATP酶（巴佛洛霉素A1；bafilomycin A1）干扰的前提下，受到组织细胞中的氢钾ATP酶的水解，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），所产生的峰值变化（340nm），来定量分析氢/钾ATP酶的特异活性。其反应系统为：

产品内容

清理液（Reagent A）        60 毫升

裂解液（Reagent B）        10 毫升

缓冲液（Reagent C）        20 毫升

酶促液（Reagent D）        500 微升

反应液（Reagent E）        2.5 毫升

底物液（Reagent F）        2.5 毫升

阴性液（Reagent G）        1 毫升

产品说明书             1 份

保存方式

保存清理液（Reagent A）在 4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；底物液（Reagent F），避免光照，有效保证 6 月。

用户自备

15 毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

1.5 毫升离心管：用于样品制备和保存的容器

微型台式离心机：用于样品制备

培养箱：用于反应孵育

比色皿：用于光度分析的容器

分光光度仪：用于光度分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；底物液（Reagent F）注意避光。然后进行下列操作。

一、 样品准备（总蛋白制备）

1． 手术取出动物组织，并秤重以确定组织重量

2． （选择步骤）放进预冷的 15 毫升锥形离心管

3． （选择步骤）加入适量的（500 毫克组织需要 3 毫升）清理液（Reagent A）清洗 1 次

4． 移入到一个液氮冻存管

5． 即刻放进液氮罐过夜

6． 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）

7． 放进一个 15 毫升锥形离心管

8． 加入预冷的 500 微升裂解液（Reagent B）

9． 转移到预冷的 1.5 毫升离心管

10．强力涡旋震荡 30 秒，充分混匀

11．置于冰槽里孵育 30 分钟，期间每 10 分钟强力涡旋震荡 30 秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）

12．放进 4℃微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 16000g（或 13000RPM，例如 eppendorf 5415）

13．小心移取 500 微升上清液到新的预冷的 1.5 毫升离心管

14．移取 10 微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

15．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测定准备

1． 准备好上述待测样品，置于冰槽里

2． 设定好分光光度仪（温度为 37℃）：波长为 340nm，间隔 5 分钟，读数 5 次（共 20 分钟），并置零

3． 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、 背景对照测定

1． 移取 730 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 20 微升酶促液（Reagent D）

3． 加入 100 微升反应液（Reagent E）

4． 加入 100 微升底物液（Reagent F）

5． 放进 37℃培养箱里静置 3 分钟

6． 加入 50 微升阴性液（Reagent G）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340 波长读数 0 分钟 －340 波长读数 20 分钟

四、 样品活性测定

1． 移取 730 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 20 微升酶促液（Reagent D）

3． 加入 100 微升反应液（Reagent E）

4． 加入 100 微升底物液（Reagent F）

5． 放进 37℃培养箱里静置 3 分钟

6． 加入 50 微升待测样品（注意：100 微克总蛋白；样品须溶解）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340 波长读数 0 分钟 －340 波长读数 20 分钟

五、 计算样品活性

[（样品读数－背景读数）X 1 （体系容量，毫升）X 样品稀释倍数]÷[0.05（样品容量，毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 10 或 20（反应时间，分钟）]＝单位/毫升

或者

[（样品读数－背景读数）X 1 （体系容量，毫升）X 样品稀释倍数]÷[0.1（样品重量，毫克）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 10 或 20（反应时间，分钟）]＝单位/毫克

单位＝微摩尔 NADH/分钟

注意事项

1． 本产品为 20 次操作，包括背景对照

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，背景测定只需 1 次

4． 样品忌用磷酸缓冲溶液

5． 建议使用动物组织微粒体、液泡或质膜样品；本公司提供的动物组织膜性囊泡（RSOV 和 IOV）制备试剂盒（10169.2）

6． 加入样品启动反应后 3 秒内即刻光度测定

7． 反应测定值由高到低变化；测定可以持续 20 分钟

8． 测定值由高到低变化，即 0 分钟测定读数高于 10 分钟或 20 分钟测定读数，表明有酶活性

9． 光度测定后，比色皿须清洗彻底

10．建议待测样本蛋白浓度为 100 微克/50 微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；注意计算公式的调整（本公司提供 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒 30030.1）

11．氢/钾 ATP 酶活性单位浓度定义：在 37℃温度下，pH 7.5 条件下，每分钟内能够氧化 1 微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位

12．本公司提供系列 ATP 酶类技术产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测准确

使用承诺

用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后 10 天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

说明书下载

如需要【动物组织氢/钾ATP酶(H＋/K＋－ATPase)活性比色法定量检测试剂盒】电子版说明书及相关资料，请联系客服索取！

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更新时间：2020-12-15 12:00:49    作者：羽哚生物     点击：613次