细胞钙调神经磷酸酶(CALCINEURIN；PP2B)活性定磷比色法定量检测试剂盒

主要用途

细胞钙调神经磷酸酶（CALCINEURIN；PP2B）活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用特异性合成底物RII 磷酸化肽（RII Phosphopeptide），在 PP2B 去磷酸化后，释放出游离磷酸根，由硫酸亚铁氨还原产生钼蓝显色反应后峰值的变化，即采用比色法测定单位酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种细胞裂解悬液样品的钙调神经磷酸酶活性及其抑制剂的检测。广泛应用于细胞凋亡、蛋白组学、病理生理学、神经病变等研究。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景

钙调神经磷酸酶（calcineurin或protein phosphatase-2B；PP-2B）是钙离子依赖性丝氨酸/苏氨酸激酶家属的成员之一。在机体的脑组织、肌肉组织以及免疫细胞等丰富表达。且高度进化保留。其作用于细胞繁殖、分化和死亡的信号传导。钙调神经磷酸酶是异构二聚体，由60Kd的A催化亚体和19Kd的B调节亚体组成。通过钙离子结合在B亚体和钙调素（calmodulin）上，使A亚体发生结构改变，底物可以接触到催化区域，而发生作用。

产品内容

清理液（Reagent A）

裂解液（Reagent B）

缓冲液（Reagent C）

阴性液（Reagent D）

反应液（Reagent E）

显色液（Reagent F）

标准液（Reagent G）

产品说明书

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、缓冲液（Reagent C）、反应液（Reagent E）和显色液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在 4℃冰箱里；显色液（Reagent F）具有腐蚀性，避免直接用手接触；有效保证 6 月。

用户自备

15 毫升离心管：用于样品处理的容器

1.5 毫升离心管：用于样品处理和保存的容器

细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离

（微型）台式离心机：用于样品收集

培养箱：用于孵育反应物2

比色皿或酶标板：用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液放进冰槽里融化。然后进行下列操作。

一、 样品准备

1． 准备好 25cm2细胞培养瓶或 60mm 细胞培养皿的待测培养细胞（5 X 10 6细胞）

2． 小心加入 xx 毫升预冷的清理液（Reagent A），覆盖生长表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞

5． 加入 xx 毫升清理液（Reagent A），混匀细胞

6． 移入到预冷的 15 毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）

7． 放进 4℃台式离心机离心 5 分钟，速度为 300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入 xx 微升裂解液（Reagent B），充分混匀

10．转移到预冷的 1.5 毫升离心管

11．强力涡旋震荡 15 秒

12．置于冰槽里孵育 30 分钟

13．放进 4℃微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 16000g（或 13000RPM，例如 eppendorf 5415）

14．小心移取 500 微升上清液到新的预冷的 1.5 毫升离心管

15．移取 2 微升进行蛋白定量测定（注意：建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

16．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测定准备

1． 准备好待测样品（例如细胞裂解萃取液等），置于冰槽里（注意：样品须澄清）

2． 设定好分光光度仪或酶标仪（温度为 37℃）：波长为 660nm，并置零

3． 准备好 5 个 1.5 毫升离心管，标记为 1 至 5 号管

4． 按下表分别加入阴性液（Reagent D）和标准液（Reagent G）到每个离心管，混匀

5． 将 1 至 5 号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

三、 标准曲线测定

1． 移取 200 微升上述配制的标准液到新的比色皿2． 在 30℃温度下孵育 10 分钟

3． 加入 xx 微升显色液（Reagent F），混匀

4． 在 37℃温度下孵育 10 分钟，避免光照

5． 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数

6． 重复实验步骤 1 至 5 四次

7． 构建标准曲线：纵座标（Y 轴）为吸光单位（A）；横座标（X 轴）为标准磷浓度（微摩尔/升）

四、 样品背景测定

1． 移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 20 微升待测样品（总量 100 微克细胞裂解萃取液蛋白；作为样品背景）

3． 在 30℃温度下孵育 10 分钟

4． 加入 xx 微升阴性液（Reagent D），混匀

5． 加入 xx 微升显色液（Reagent F），混匀

6． 在 37℃温度下孵育 10 分钟，避免光照

7． 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数

8． 根据标准曲线获得样品背景对应磷浓度

五、 样品活性测定

1． 移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 20 微升待测样品（总量 100 微克细胞裂解萃取液蛋白）

3． 在 30℃温度下孵育 2 分钟

4． 加入 xx 微升反应液（Reagent E）

5． 在 30℃温度下孵育 10 分钟

6． 加入 xx 微升阴性液（Reagent D），混匀

7． 加入 xx 微升显色液（Reagent F），混匀

8． 在 37℃温度下孵育 10 分钟，避免光照

9． 即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数

10．根据标准曲线获得样品活性对应磷浓度

六、 计算样品活性

计算公式参考随货纸质版说明书

七、酶标仪测定

1． 在 96 孔板上做好相应标记：标准样品、样品背景、样品活性

2． 分别移取 100 微升上述配制的标准液到相应的标准样品孔里

3． 分别移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到样品背景和待测样品孔里

4． 分别加入 10 微升待测样品（总量 100 微克细胞裂解萃取液蛋白）到样品背景和样品活性孔里

5． 加入 xx 微升反应液（Reagent E）到样品活性孔里

6． 加入 xx 微升阴性液（Reagent D）到样品背景孔里

7． 在 30℃温度下孵育 10 分钟

8． 分别加入 xx 微升阴性液（Reagent D）到样品背景和待测样品孔里

39． 分别加入 xx 微升显色液（Reagent F）到所有孔里

10．轻轻摇动酶标板

11．在 37℃温度下孵育 10 分钟，避免光照

12．即刻放进酶标仪检测：获得吸光读数

13．构建标准曲线：纵座标（Y 轴）为吸光单位（A）；横座标（X 轴）为标准磷浓度（微摩尔/升）

14．根据标准曲线获得样品对应磷浓度

15．计算样品活性

注意事项

1． 本产品为 25 次操作，包括 5 次（点）标准测定

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，标准曲线测定只需 1 条

4． 显色液（Reagent F）具有腐蚀性，避免直接用手接触

5． 样品切忌使用磷酸缓冲液和脱氧胆酸纳处理

6． 比色测定后，比色皿须清洗彻底

7． 如果用户没有 660nm 波长，可以使用 600 至 660nm 的任一波长替代

8． 吸光读数增高，表明具有酶活性

9． 建议待测样本蛋白浓度为 100 微克/20 微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；（本公司提供 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

10．钙调神经磷酸酶活性单位浓度定义：在 30℃温度下，pH 8.0 的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）释放 1 微摩尔的磷

11．本公司提供系列磷酸化酶检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测准确

使用承诺

用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后 10 天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

说明书下载

如需要【细胞钙调神经磷酸酶(CALCINEURIN；PP2B)活性定磷比色法定量检测试剂盒】电子版说明书及相关资料，请联系客服索取！

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更新时间：2020-12-15 12:00:49    作者：云羽生物     点击：1100次