活化凝血因子9(FACTORIXa)活性荧光定量检测试剂盒

主要用途

活化凝血因子 9（FACTOR IXa）活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过活化凝血因子 XI（FXIa）激活获得活化因子 IX（FIXa）与辅因子活化凝血因子 8（FVIIIa）一起，激活凝血因子 X（FXa），进而水解多肽化合物底物 N-α-z-D-Arg-Gly-Arg-AMC，释放出荧光产物氨甲基香豆素，产生荧光峰值的变化，即采用荧光法来测定血液样品中活化凝血因子 IX 活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种血浆样品（动物、人体等）活化凝血因子 9 的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

凝血因子9（Factor IX；EC3.4.21.22），又称为圣诞因子（Christmas Factor）是维生素K依赖性单链丝氨酸蛋白酶，为血浆糖蛋白，55kD分子量，为正常血液凝固中间阶段所必需。由接触通路中的活化凝血因子11（FX1a）或组织因子通路中的活化凝血因子7（FVIIa）切离其前体而使因子9活化，进一步激活凝血因子10。一旦缺失，则导致严重出血性疾病血友病B；活性过高，则导致血栓病。凝血因子9的检测，可以识别其缺失，评价其浓度，检测替代治疗效果。通过活化凝血因子11，获得活化凝血因子9（FIXa），和凝血酶激活的辅因子活化凝血因子8（FVIIIa）一起，在钙离子和磷脂的参与下，使凝血因子10（FX）活化，由此水解人工合成的多肽化合物底物N-α-z-D-Arg-Gly-Arg-7-amido-4-methyl coumarin（D-精氨酰-甘氨酰-精氨酰氨甲基香豆素），7-氨基-4-甲基香豆素（7-amido- 4-methylcoumarin；AMC；激发波长360nm；散发波长460nm），来定量测定活化凝血因子IX的活性。其反应系统为：

产品内容

缓冲液（Reagent A）

反应液（Reagent B）

底物液（Reagent C）

标准液（Reagent D）

产品说明书

保存方式

保存在-20℃冰箱里，避免反复冻融；底物液（Reagent C）和标准液（Reagent D）避免光照；有效保证 6月。

用户自备

抗凝管：用于血液采集的容器

1.5 毫升离心管：用于样品操作的容器

微型台式离心机：用于样品操作

培养箱：用于反应物孵育

黑色 96 孔板或 100 微升 1 厘米光径比色皿：用于样品荧光测定的容器

荧光酶标仪或荧光分光光度仪：用于样品荧光分析

实验步骤2

一、 样品制备

1． 准备好 ACD 抗凝管（注意：避免使用肝素和 EDTA 抗凝管）

2． 抽取 1 毫升血液，置于抗凝管里

3． 放进 4℃微型台式离心机离心 10 分钟，速度为 700g（或 3000RPM，例如 eppendorf 5415）

4． 小心移取上层黄色液体到新的 1.5 毫升离心管――此为血浆成分（注意：避免触碰白色液体层）

5． 移取 10 微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

6． 移取 10 微升血浆到新的 1.5 毫升离心管

7． 加入 xx 微升缓冲液（Reagent A），混匀

8． 即刻置于冰槽里备用（注意：30 分钟内使用）

二、 测定准备

1．准备好待测样品，置于冰槽里

2．设定好荧光分光光度仪（温度为 37℃）：激发波长 360nm，散发波长 460nm，根据实际读数调整增益倍数（注意：建议 150）

3．实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂置入冰槽里融化。缓冲液（Reagent A）室温下均衡温度

4．准备好 5 个 1.5 毫升离心管，标记为 1 至 5 号管

5．分别加入 xx 微升缓冲液（Reagent A）到 2 至 5 号管

6．移取 xx 微升标准液（Reagent D）到 1 号管，混匀

7．小心移取 xx 微升 1 号管稀释的标准液（Reagent D）到 2 号管，混匀

8．小心移取 xx 微升 2 号管稀释的标准液（Reagent D）到 3 号管，混匀

9．小心移取 xx 微升 3 号管稀释的标准液（Reagent D）到 4 号管，混匀

10． 将 1 至 5 号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

三、活性测定

1． 在黑色 96 孔板上做好相应标记：标准样品和待测样品

2． 移取 10 微升上述制备的样品（或 50 微克蛋白）到待测样品孔里

3． 移取 10 微升上述制备的标准样品到标准样品孔里

4． 分别加入 xx 微升反应液（Reagent B）

5． 分别加入 xx 微升缓冲液（Reagent A）

6． 在 37℃温度下孵育 15 分钟

7． 分别加入 xx 微升底物液（Reagent C），混匀

8． 在 37℃温度下孵育 30 分钟

9． 即刻放进荧光酶标仪检测或转移到 100 微升比色皿，在荧光分光光度仪里检测：获得相对荧光读数（Relative Fluorescence Unit；RFU）

10．实际读数：1 至 4 号管标准样品读数或待测样品读数—5 号管空对照读数11．构建标准曲线：纵座标（Y 轴）为相对荧光单位（RFU）；横座标（X 轴）为标准 AMC 浓度（微摩尔/升）

12．根据标准曲线获得样品对应 AMC 浓度（微摩尔/升）

13．活性计算：公式参考随货纸质版说明书。

注意事项

1． 本产品为 20 次操作

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，标准曲线测定只需 1 次

4． 样品须澄清，且避免反复冻融

5． 如果为非血浆样品，可以跳过样品预处理，直接进行样品活性检测

6． 测定值由低到高变化

7． 荧光测定后，比色皿须清洗彻底

8． 样本测定读数高于空对照读数表明具有酶活性

9． 建议待测样本蛋白浓度为 50 微克/10 微升（本公司提供 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒 30030.1）

10．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

11．用户可以自行建立标准范围

12．用户可以使用活化凝血因子 9（另购）构建标准曲线

13．活化凝血因子 9 单位活性定义为：在 37℃，pH 8.0 条件下，每分钟内能够切离 1 纳摩尔多肽化合物底物 N-α-z-D-Arg-Gly-Arg-AMC 所需的酶量作为一个活性单位

14．本公司提供系列凝血因子检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感

使用承诺

用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后 10 天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

说明书下载

如需要【活化凝血因子9(FACTORIXa)活性荧光定量检测试剂盒】电子版说明书及相关资料，请联系客服索取！

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更新时间：2020-12-15 12:00:39    作者：羽哚生物     点击：545次