端粒酶活性TRAP实时定量检测试剂盒

主要用途

端粒酶活性 TRAP 实时定量检测试剂是一种旨在运用 SYBR 绿色荧光染料作为标记信号，结合端粒重复序列扩增方法（TRAP），既方便、快速地进行各种 DNA 模板的扩增，又实时检测和定量分析扩增产物，即端粒酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。广泛应用于肿瘤、衰老等研究。产品即到即用，性能稳定，无核酶污染，操作便捷，敏感高效，定量准确，重复性强，效果满意，质量保证。

技术背景

端粒酶（telomerase）是一种核糖核蛋白酶（ribonuleoprotein），与人体细胞永生化（immortalization）和转化（transformation）有关。端粒重复序列扩增方法（telomeric repeat amplification protocol；TRAP）是基于多聚酶联扩增的敏感高效的体外端粒酶活性的检测技术。首先，非端粒单核苷酸引物作为端粒酶的底物而持续延长产生六碱基差异的片段；然后，延长所获得的产物在非端粒单核苷酸引物和逆向引物的参与下进行特异性扩增。SYBR 绿色荧光染料，作为 DNA 结合染料，可以和扩增子（amplican）上双链 DNA 的任一小沟（minor groove）结合，而发出荧光信号。根据每一循环的荧光强度来确定扩增产物的产量，并用循环阈值（threshold cycle；Ct）表示。TRAP 实时定量 PCR 技术十倍敏感于常用 TRAP 电泳技术，同时避免二聚体产生的假阳性干扰。

产品内容

裂解液（Reagent A）

反应液（Reagent B）

染色液（Reagent C）

补充液（Reagent D）

封隔液（Reagent E）

产品说明书

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；染色液（Reagent C）避免光照，有效保证 6 月。

用户自备

1.5 毫升离心管：用于样品制备和保存的容器

微型台式离心机：用于样品沉淀收集

PCR 管：用于样品扩增操作的容器

荧光定量 PCR 仪：用于荧光定量 PCR 反应

实验提示

一、 样品制备

1）细胞样品制备

1． 准备 1 个细胞培养 6 孔板的单孔细胞，直至生长至 80％铺满率（1 X 10 5 细胞）

2． 小心抽去细胞培养液

3． 用细胞刮脱棒刮落细胞转移到 1.5 毫升离心管

4． 放进微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 3000g（或 6000RPM，例如 eppendorf 5415）

5． 小心抽去上清液

6． 小心加入 xx 微升预冷的裂解液（Reagent A），混匀细胞颗粒群

7． 放进冰槽里孵育 30 分钟

8． （选择步骤）放进 4℃微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 16000g（或 13000RPM，例如 eppendorf 5415）

9． （选择步骤）小心移取上清液到新的 1.5 毫升离心管

10．移取 5 微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

11．即刻放进－70℃冰箱里保存或置于冰槽里备用

2）组织样品制备

1． 手术取出动物组织，并秤取 50 毫克待测组织

2． 移入到一个液氮冻存管

3． 即刻放进液氮罐过夜

4． 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）

5． 放进 DOUNCE 匀浆器

6． 加入 xx 微升预冷的裂解液（Reagent A）

7． 匀化 80 下

8． 小心转移到 1.5 毫升离心管

9． 放进冰槽里孵育 30 分钟

10．即刻放进 4℃微型台式离心机离心 10 分钟，速度为 16000g （或 13000RPM，例如 eppendorf 5415）

11．小心移取上清液到新的无菌的 1.5 毫升离心管

12．移取 5 微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

13．放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

二、 定量检测

1． 一次反应总量为 25 微升

2． 移取 xx 微升反应液（Reagent B）到 0.5 毫升 PCR 管

3． 加入 1 微升待测的细胞或组织裂解悬液（总量为 250 纳克总蛋白；注意：严格避免 RNA 酶污染）

4． 加入 xx 微升染色液（Reagent C）

5． 加入 xx 微升补充液（Reagent D）到总量 25 微升

6． 放进 4℃微型台式离心机瞬时离心 5 秒

7． 使用 xx 微升枪头加入 1 滴封隔液（Reagent E）（注意：参见注意事项 9）

8． 即刻放进荧光定量 PCR 仪

9． 荧光定量 PCR 反应程序为：

温度（℃）    时间    循环

30                            20 分钟    1

95                                30 秒    35

60                                90 秒

10．采集数据，进行溶解曲线分析

11．PCR 产物置于－20℃保存备用

注意事项

1.本产品为 20 次 PCR 反应

2.操作时，须戴手套

3.本产品适合各种荧光定量 PCR 仪

4.建议整个操作在 4℃下进行

5.必须使用带滤芯的枪头

6.所有器皿、离心管、液体等无 RNA 酶污染

7.使用时，避免污染母液

8.建议使用裂解液或无离子水作为阴性对照

9.根据用户 PCR 仪的性能，决定是否加入封隔液（Reagent E）

10. 配制完成后，即刻进行扩增反应，以确保反应物的活性

11. 试剂避免反复冻融

12. 通常样品量范围为 1.6 纳克至 1 微克；理想范围为 250 纳克；如果没有反应，可能样品中存在 PCR 抑制剂，建议调整样品量为 100 至 200 纳克

13. PCR 扩增反应的最初 3 个循环为定量基线；3 至 15 个循环的荧光信号的 10 倍值为荧光阈值；荧光信号达到阈值所需的循环数为 Ct 值（参考图像如下）：其中 6 号为阴性对照

14. Ct 值作为端粒酶活性的计量单位

15. 用户可以使用 293 细胞（10，100，和 1000 细胞数）作为阳性对照，以此建立标准曲线：横座标（X轴）为细胞量对数，纵座标（Y 轴）为 Ct 值

16. 如果检测卵细胞样品，建议平均每个卵细胞使用 5 微升裂解液（Reagent A）裂解细胞，孵育 60 分钟，取 1/10 至 1/20 的卵细胞量，进行定量扩增反应

17. 本公司提供系列端粒酶活性检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定无核酶污染

3． 本产品经鉴定反应灵敏

使用承诺

用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后 10 天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

说明书下载

如需要【端粒酶活性TRAP实时定量检测试剂盒】电子版说明书及相关资料，请联系客服索取！

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更新时间：2020-12-15 12:00:36    作者：羽哚生物     点击：624次