组织单胺氧化酶B型（MAO-B）活性比色法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途

组织单胺氧化酶B型（MAO-B）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过单胺氧化酶和过氧化酶耦联反应系统中，在A型单胺氧化酶抑制剂的存在下，底物对羟基苯乙胺氧化产物过氧化氢，与4-氨基安替比林反应产生红色醌亚胺染料后峰值的变化，即采用比色法来测定组织裂解悬液样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物或人体组织样品、部分或完全纯化酶样品中A型单胺氧化酶（MAO-B）的特异活性检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。常用于药理学、毒理学等研究。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

单胺氧化酶（monoamine oxidase；MAO；EC1.4.3.4），属于黄素类胺氧化还原酶（flavin containing amine oxidoreductase），催化单胺，例如对羟基苯乙胺（p-tyramine）和各种神经传递介质等生命必需的或外源性胺化合物（xenobotic）氧化的酶，存在于体内大多数细胞，尤其神经细胞的线粒体外膜上。单胺氧化酶有2种亚型：A型和B型。A型主要在肝脏、胃肠道和胎盘细胞，降解羟色胺（Serotonin）、去甲肾上腺素（Norepinephrine）、肾上腺素（epinephrine）和多巴胺（dopamine）等，同时被氯吉兰（clorgyline）抑制；B型主要在血小板上，降解苯乙胺（Phenethylamine）、苄胺（Benzylamine）和多巴胺（dopamine）等，同时被司来吉兰（deprenyl）和巴吉林（pargyline）抑制。单胺氧化酶催化单胺的氧化脱氨作用，产生乙醛和氨气。A型单胺氧化酶异常将导致抑郁、注意力缺失、物质瘾性（Substance Abuse）等疾患，而B型单胺氧化酶异常将导致阿兹罕默症、巴金森氏症、亨廷顿疾患等。基于底物对羟基苯乙胺在A型单胺氧化酶抑制剂氯吉兰（clorgyline）的存在下，受到B型单胺氧化酶的催化，产生乙醛和过氧化氢（hydrogenperoxide），进而通过过氧化酶（peroxidase）的催化，使生色染料4-氨基安替比林（4-aminoantipyrine）氧化，由香草酸（Vanillic acid）浓缩成红色醌亚胺染料（quinoneimine dye），而发生吸光值的变化（498nm波长），来定量测定单胺氧化酶B型的特异活性。单胺氧化酶B型反应系统为：

产品内容

清理液（Reagent A）  60毫升

裂解液（Reagent B）  10毫升

缓冲液（Reagent C）   2毫升

反应液（Reagent D）    1毫升

底物液（Reagent E）   1毫升

阴性液（Reagent F）   500微升

产品说明书        1份

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、缓冲液（Reagent C）、反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；反应液（Reagent D）避免光照，有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

恒温培养箱：用于反应液孵育

微型台式离心机：用于样品制备

200微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂置入冰槽里融化。反应液（Reagent D）避免光照。然后进行下列操作。

一、 样品准备 

1． 手术取出动物组织，并秤重以确定200至500毫克组织重量 

2． （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管

3． （选择步骤）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次

4． 移入到一个液氮冻存管

5． 即刻放进液氮罐过夜

6． 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）

7． 放进一个15毫升锥形离心管

8． 加入置于冰槽里的200至500微升裂解液（Reagent B） 

9． 强力涡旋震荡30秒，充分混匀

10． 放进冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）

11． 即刻放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1000g

12． 小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管

13． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

14． 放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

二、 测定准备

1． 准备好上述待测样品，置于冰槽里

2． 设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长498nm，间隔10分钟，读数7次（共60分钟），并置零或设置0分钟和60分钟各测读1次

3． 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、 背景对照测定

1． 移取100微升缓冲液（Reagent C）到到1.5毫升离心管

2． 加入50微升阴性液（Reagent F）

3． 在37℃温度下孵育30分钟

4． 置于冰槽里备用

5． 加入50微升反应液（Reagent D）新的比色皿

6． 加入50微升底物液（Reagent E）

7． 加入上述准备的150微升含有缓冲液（Reagent C）和阴性液（Reagent F）的背景空对照溶液

8． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

9． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（60分钟读数－0分钟读数） 

四、 样品测定

1． 移取100微升缓冲液（Reagent C）到1.5毫升离心管

2． 加入50微升待测样品（注意：50微克蛋白总量） 

3． 在37℃温度下孵育30分钟

4． 置于冰槽里备用

5． 加入50微升反应液（Reagent D）新的比色皿

6． 加入50微升底物液（Reagent E）

7． 加入上述准备的150微升含有缓冲液（Reagent C）的样品溶液

8． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

9． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（60分钟读数－0分钟读数）

五、 计算样品活性

六、 酶标仪测定

1． 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品

2． 分别移取100微升缓冲液（Reagent C）到相应孔里

3． 分别加入50微升阴性液（Reagent F）或待测样品（50微克蛋白总量） 

4． 在37℃温度下孵育30分钟

5． 置于冰槽里备用

6． 分别加入50微升反应液（Reagent D）到新的测定孔里

7． 分别加入50微升底物液（Reagent E）

8． 分别加入上述准备的150微升含有缓冲液（Reagent C）的空背景对照或样品溶液

9． 轻轻摇动96孔板

10． 即刻放进酶标仪检测，包括（0分钟初始读数和60分钟读数）

11． 活性计算

注意事项

1． 本产品为20次操作，包括背景对照

2． 操作时，须戴手套

3． 建议样品保存在－70℃冰箱里 

4． 系统操作过程中，背景测定只需1次

5． 加样后3秒内比色测定

6． 测定值由低到高变化；测定持续60分钟 

7． 比色测定后，比色皿须清洗彻底

8． 样本测定60分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性

9． 建议待测样本蛋白浓度为50微克/50微升；如果样本酶活性过低或过高， 则可以增加或降低样本量（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒30030.1）

10． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

11． 正常大鼠肝脏B型单胺氧化酶活性为35纳摩尔/小时/毫克蛋白

12． 单胺氧化酶B型单位活性定义为：在37℃，pH 7.6条件下，每小时内能够氧化1微摩尔对羟基苯乙胺所需的酶量作为一个活性单位

13． 本公司提供系列单胺氧化酶类检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感

使用承诺

用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

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