细胞PLK1激酶活性光度法定量检测试剂盒说明书

主要用途

细胞 PLK1 激酶活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物，在 PLK1 激酶敏感性抑制剂存在与否的情况下，受到 PLK1 磷酸化后，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生 ADP 过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光度法测定其氧化后吸光峰值的变化，以分析细胞裂解样品中 PLK1 活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或完全纯化酶样品中 PLK1 激酶的定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。

技术背景

Polo样激酶（Polo like kinase；PLK；EC2.7.11.21），属于丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine protein kinase；EC2.7.11-）家属的成员，是细胞周期调节的重要酶蛋白之一。其功能在于参与细胞周期有丝分裂和胞质分裂（cytokinesis）、M期的有丝分裂纺锤体（spindle）的形成与变化、中心体（centrosome）的装配和分离、CDK/Cyclin（细胞周期素依赖性激酶/细胞周期素）复合物的激活，以及DNA损伤反应。哺乳动物PLK拥有5个同工酶，包括Plk1/STPK13（或非洲爪蟾Xenopus Plx1）、Plk2/Snk（非洲爪蟾Xenopus Plx2）、Plk3/Prk/Fnk/Cnk（非洲爪蟾Xenopus Plx3）、Plk4/Sak/STK18和Plk5。Plk1和2、3互相高度同源，与Plk4有较大差异。PLK具有高度进化保留，包括果蝇Polo、酵母Plo1和Cdc5等。PLK含有N-端典型的（canonical）催化结构域和C端调节结构域，调节结构域上的Polo Boxes（PD）帮助酶蛋白的定位和底物识别。其中Plk1，

66Kd分子量，603氨基酸残基，存在于所有正常繁殖生长的组织，主要位于中心体或纺锤体上，是细胞分裂的关键调节因子（master regulator），与有丝分裂进出、中心体成熟、两极纺锤体（bipolar spindle）形成、姊妹染色单体分离（sister chromatid splitting）、分裂后期促进复合物（anaphase promoting complex/cyclosome；APC/C）的激活、减数分裂（meiosis）调节、高尔基体功能有关。其磷酸化底物为cdc25C、cyclin B、cohesin、kinesin related motor protein、Wee1、Myt1、p53、Emil1等、一旦活性抑制，将导致有丝分裂不全，细胞死亡，并具有抗肿瘤功效；过度表达，将导致肿瘤，并预后不佳。其磷酸化目标序列之一为CKKLGEDQAEEISDDLLEDSLSDEDE。基于底物CKKLGEDQAEEISDDLLEDSLSDEDE，源自于Cdc25C，在Plk1激酶敏感性抑制剂SBE13（N-（4-（（6-chloro-3-pyridinyl）methoxy）-3-methoxybenzyl）-N-（2-

（3,4-dimethoxyphenyl）ethyl）amine） 存在与否的情况下，受到Plk1激酶的磷酸化，获得产物磷酸化多肽，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析Plk1的特异活性。其反应方式为：（联系客服索取）

产品内容

清理液（Reagent A）

裂解液（Reagent B）

缓冲液（Reagent C）

酶促液（Reagent D）

反应液（Reagent E）

底物液（Reagent F）

阴性液（Reagent G）

专性液（Reagent H）

产品说明书

保存方式

保存清理液（Reagent A）在 4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保证 6 月。

用户自备

Plk1 激酶：用于抑制剂筛选

1.5 毫升离心管：用于样品保存的容器

15 毫升锥形离心管：用于样品处理的容器

细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离

（微型）台式离心机：用于样品预处理

比色皿或 96 孔板：用于光度分析操作的容器

分光光度仪或酶标仪：用于样品光度分析

实验步骤

一、 待测样品准备

1． 准备好 75cm2细胞培养瓶或 100mm 细胞培养皿的待测培养细胞（1 至 5 X 10 7细胞）

2． 小心加入 xx 毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）

5． 加入 xx 毫升清理液（Reagent A），混匀细胞

6． 移入到预冷的 15 毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）

7． 放进 4℃台式离心机离心 5 分钟，速度为 300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入 xx 微升裂解液（Reagent B），充分混匀

10．转移到预冷的 1.5 毫升离心管

11．强力涡旋震荡 15 秒

12．置于冰槽里孵育 30 分钟

13．放进 4℃微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 16000g（或 13000RPM，例如 eppendorf 5415）

14．小心移取 500 微升上清液到新的预冷的 1.5 毫升离心管

15．移取 10 微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

16．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、 测定准备

1． 准备好待测样品（例如细胞裂解悬液等），置于冰槽里

2． 设定好分光光度仪（温度为 30℃）：波长为 340nm，间隔 1 分钟，读数 6 次（共 5 分钟），并置零3． 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、 背景对照测定

1． 移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升酶促液（Reagent D）

3． 加入 xx 微升反应液（Reagent E）

4． 加入 xx 微升底物液（Reagent F）

5． 放进 30℃培养箱里静置 3 分钟

6． 加入 xx 微升阴性液（Reagent G）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340 波长读数 0 分钟 －340 波长读数 5 分钟

四、 样品总活性测定

1． 移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升酶促液（Reagent D）

3． 加入 xx 微升反应液（Reagent E）

4． 加入 xx 微升底物液（Reagent F）

5． 放进 30℃培养箱里静置 3 分钟

6． 加入 5 微升待测样品（注意：50 微克细胞裂解蛋白；样品须溶解）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340 波长读数 0 分钟 －340 波长读数 5 分钟

五、 样品非特异活性测定

检测开始前，移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到 1.5 毫升离心管，分别加入 xx 微升专性液（Reagent H）和待测样品（注意：50 微克细胞裂解蛋白），混匀后，放进 30℃培养箱里孵育 30 分钟。然后继续下列操作。

1． 移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升酶促液（Reagent D）

3． 加入 xx 微升反应液（Reagent E）

4． 加入 xx 微升底物液（Reagent F）

5． 放进 30℃培养箱里静置 3 分钟

6． 加入 20 微升上述预处理的待测样品

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：340 波长读数 0 分钟 －340 波长读数 5 分钟

六、 计算样品活性（联系客服索取）

1） 样品总活性和非特异活性计算

2）样品特异活性计算

七、酶标仪测定

1） 样品总活性测定

1． 在 96 孔板上做好相应标记：背景对照和样品

2． 分别移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到 96 孔板里

3． 分别加入 xx 微升酶促液（Reagent D）

4． 分别加入 xx 微升反应液（Reagent E）

5． 分别加入 xx 微升底物液（Reagent F）

6． 轻轻摇动 96 孔板

7． 在 30℃温度下孵育 3 分钟

8． 分别加入 xx 微升阴性液（Reagent G）或待测样品（50 微克细胞裂解悬液蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）

9． 轻轻摇动 96 孔板

10．即刻放进酶标仪检测：0 分钟读数和 5 分钟读数

11．活性计算：（联系客服索取）

2） 样品非特异活性测定

检测开始前，移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到 1.5 毫升离心管，分别加入 xx 微升专性液（Reagent H）和待测样品（注意：50 微克细胞裂解蛋白），混匀后，放进 30℃培养箱里孵育 30 分钟。然后继续下列操作。

1． 在 96 孔板上做好相应标记：待测样品

2． 移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到 96 孔板里

3． 加入 xx 微升酶促液（Reagent D）

4． 加入 xx 微升反应液（Reagent E）

5． 加入 xx 微升底物液（Reagent F）

6． 轻轻摇动 96 孔板

7． 在 30℃温度下孵育 3 分钟

8． 加入 20 微升上述预处理的待测样品

9． 轻轻摇动 96 孔板

10．即刻放进酶标仪检测：0 分钟读数和 5 分钟读数

11．活性计算：

3） 样品特异活性计算

特异活性＝总活性－非特异活性

八、抑制剂筛选

1． 在 96 孔板上做好相应标记：背景、完全活性和待测抑制剂样品

2． 按下表加入试剂，进行样品预处理

3． 分别移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的 96 孔板的所有孔里

4． 分别加入 xx 微升酶促液（Reagent D）

5． 分别加入 xx 微升反应液（Reagent E）

6． 分别加入 xx 微升底物液（Reagent F）

7． 轻轻摇动 96 孔板

8． 在 30℃温度下孵育 3 分钟

9． 加入 20 微升上述预处理的待测样品

10．即刻放进 30℃酶标仪检测：测读 30 分钟

11．抑制活性计算：（联系客服索取）

注意事项

1． 本产品为 20 次操作

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，背景测定只需 1 次

4． 样品处理忌用磷酸缓冲溶液

5． 样品须澄清，至关重要

6． 如果出现明显的干扰现象，建议使用样本背景对照去除任何内源性干扰因子

7． 加入样品启动反应后 3 秒内即刻光度测定

8． 测定值由高到低变化；测定可持续 30 分钟

9． 光度测定后，比色皿须清洗彻底

10．样本测定 0 分钟读数高于 5 分钟读数表明具有酶活性

11．建议待测样本蛋白浓度为 50 微克/5 微升（本公司提供 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

12．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

13．可以使用 Plk1 抑制剂作为抑制剂对照或阴性对照

14．Polo 样激酶 1 活性单位浓度定义：在 30℃温度下，pH 7.5 条件下，每分钟内能够氧化 1 微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位

15．本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感

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