细菌活力蓝色荧光(DAPI)检测试剂盒说明书

主要用途

细菌活力蓝色荧光检测试剂是一种旨在通过使用荧光染料DAPI与染色体DNA的结合并发出荧光检测信号来测定活体细菌和死亡细菌之比例的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于各种环境样品（河水、海水、市政废水、可饮用水、土壤、沉积物等）和食物样品的细菌检测。产品严格无菌，即到即用，性能稳定，荧光清晰。

技术背景

作为细胞DNA染色剂之一的4，6－二咪基－4-联苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole； DAPI）特异性地与DNA双螺旋的凹槽部分发生相互作用，从而与DNA的双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好是UV（紫外光）的激发波长356nm，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。 

产品内容

缓冲液（Reagent A）       50毫升

固定液（Reagent B）       1毫升

染色液（Reagent C）      50微升

裂解液（Reagent D）      500微升

产品说明书                      1份

保存方式

保存染色液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，染色液（Reagent C）避免光照，有效保证6月。

用户自备

针筒式过滤器：用于除去样品中的液体成分

滤膜（0.2微米孔径的硝基纤维素或醋酸纤维素或聚碳酸酯滤膜）：用于收集稀释液体中的细菌

微型台式离心机：用于细菌沉淀收集

1.5毫升离心管：用于细胞检测操作的容器

碘化丙啶（Propidium Iodide；PI）染料：用于检测死亡的细菌

37℃培养箱：用于孵育反应物

荧光显微镜：用于观察染色后具荧光的细菌

实验步骤

实验开始前，开启荧光显微镜预热。然后进行下列操作：

一、 液体样品检测（河水、海水、市政废水、可饮用水、液体食物等）

1． 准备好针筒式过滤器，滤膜为1厘米直径和0.2微米孔径的硝基纤维素或醋酸纤维素或聚碳酸酯

2． 移取10毫升液体样品到针筒式过滤器

3． 真空过滤

4． 准备1个1.5毫升离心管

5． 加入100微升缓冲液（Reagent A）

6． 选择下列方法之一继续操作：

方法一：荧光日光法

1． 加入11微升固定液（Reagent B）到上述1.5毫升离心管

2． 用手指轻轻弹动离心管，使其充分混匀

3． 再加入1微升染色液（Reagent C）到离心管

4． 用手指轻轻弹动离心管，使其充分混匀

5． 小心加入上述离心管中所有溶液到针筒式过滤器里的滤膜上，铺满整个表面

6． 在37℃培养箱里孵育30分钟，避免光照和液体蒸发

7． 真空过滤移去滤膜上的染色溶液

8． 小心移出滤膜

9． 置于载波片上

10． 即刻在荧光显微镜（1000倍）紫外波长滤波器下，观察并计数活细菌量：显示亮蓝色荧光细菌的为活细菌

11． 关掉荧光，开启白光，观察并计数总细菌量

12． 建议观察20个显微镜视野，确定总细菌量、活体细菌量和死亡细菌量及其比例

方法二：双重染色

1． 加入11微升固定液（Reagent B）到上述1.5毫升离心管

2． 用手指轻轻弹动离心管，使其充分混匀

3． 再加入1微升染色液（Reagent C）到离心管

4． 继续加入1微升（1微克/微升）用户自备的碘化丙啶（Propidium Iodide；PI）染液

5． 用手指轻轻弹动离心管，使其充分混匀

6． 小心加入上述离心管中所有溶液到针筒式过滤器里的滤膜上，铺满整个表面

7． 在37℃培养箱里孵育30分钟，避免光照和液体蒸发

8． 真空过滤移去滤膜上的染色溶液

9． 小心移出滤膜

10． 置于载波片上

11． 即刻在荧光显微镜（1000倍）紫外波长滤波器下，观察并计数：显示亮蓝色荧光细菌的为活细菌

12． 变更到红色荧光滤波器下，观察并计数：显示红色荧光细菌的为死细菌或膜损害细菌

13． 建议观察20个显微镜视野，确定活体细菌和死亡细菌的比例

二、固体样品检测（土壤、沉积物、食物等）

1． 准备好1克固体样品

2． 移入到1.5毫升离心管

3． 加入1毫升缓冲液（Reagent A）

4． 强力涡旋震荡30秒，充分混匀

5． 静置1分钟

6． 即刻移取100微升上清液体到新的1.5毫升离心管

7． 选择下列方法之一继续操作：

方法一：荧光日光法

1． 加入11微升固定液（Reagent B）到上述1.5毫升离心管

2． 用手指轻轻弹动离心管，使其充分混匀

3． 加入1微升染色液（Reagent C）到离心管

4． 用手指轻轻弹动离心管，使其充分混匀

5． 放进37℃培养箱里孵育10分钟，避免光照

6． 移出10微升离心管中的混匀物到载玻片上或血细胞计数仪上

7． 放上盖玻片

8． 即刻在荧光显微镜（1000倍）紫外波长滤波器下，观察并计数活细菌量：显示亮蓝色荧光细菌的为活细菌

9． 关掉荧光，开启白光，观察并计数总细菌量

10． 建议观察20个显微镜视野，确定总细菌量、活体细菌量和死亡细菌量及其比例

方法二：裂解法

1． 加入11微升固定液（Reagent B）到上述1.5毫升离心管

2． 用手指轻轻弹动离心管，使其充分混匀

3． 加入1微升染色液（Reagent C）到离心管

4． 用手指轻轻弹动离心管，使其充分混匀

5． 放进37℃培养箱孵育10分钟，避免光照

6． 移出10微升离心管中的混匀物到载玻片上或血细胞计数仪上的一侧样品池里

7． 加入10微升裂解液（Reagent D）到1.5毫升离心管

8． 用手指轻轻弹动离心管，使其充分混匀

9． 放进37℃培养箱里孵育10分钟，避免光照

10． 再移出10微升离心管中的混匀物到新的载玻片上或血细胞计数仪上的另一侧样品池里

11． 放上盖玻片

12． 即刻在荧光显微镜（1000倍）紫外波长滤波器下，观察并计数：显示亮蓝色荧光细菌的为活细菌，而显示暗淡或无荧光细菌的为死细菌或膜损害细菌

13． 建议观察20个显微镜视野，确定总细菌量、活体细菌量和死亡细菌量及其比例

方法三：双重染色

1． 加入11微升固定液（Reagent B）到1.5毫升离心管

2． 用手指轻轻弹动离心管，使其充分混匀

3． 加入1微升染色液（Reagent C）到离心管

4． 再加入1微升（1微克/微升）用户自备的碘化丙啶（Propidium Iodide；PI）染液

5． 用手指轻轻弹动离心管，使其充分混匀

6． 放进37℃培养箱里孵育10分钟，避免光照

7． 移出10微升离心管中的混匀物到载玻片上或血细胞计数仪

8． 放上盖玻片

9． 即刻在荧光显微镜（1000倍）紫外波长滤波器下，观察并计数：显示亮蓝色荧光细菌的为活细菌

10． 变更到红色荧光滤波器下，观察并计数：显示红色荧光细菌的为死细菌或膜损害细菌

11． 建议观察20个显微镜视野，确定活体细菌和死亡细菌的比例

处理三：菌液样品（培养细菌等）

1． 移取1毫升细菌培养瓶里的新鲜菌液到新的1.5毫升离心管

2． 放进微型台式离心机离心30秒，速度为16000g （或13000RPM，例如eppendorf 5415）

3． 小心抽去上清液

4． 加入1毫升缓冲液（Reagent A），充分混匀

5． 移出100微升细菌样品到新的1.5毫升离心管

6． 选择下列方法之一继续操作：

方法一：荧光日光法

1． 加入11微升固定液（Reagent B）到上述1.5毫升离心管

2． 用手指轻轻弹动离心管，使其充分混匀

3． 加入1微升染色液（Reagent C）到离心管

4． 用手指轻轻弹动离心管，使其充分混匀

5． 在37℃培养箱里孵育10分钟，避免光照

6． 移出10微升离心管中的混匀物到载玻片上或血细胞计数仪

7． 放上盖玻片

8． 即刻在荧光显微镜（1000倍）紫外波长滤波器下，观察并计数活细菌量：显示亮蓝色荧光细菌的为活细菌

9． 关掉荧光，开启白光，观察并计数总细菌量

10． 建议观察3个显微镜视野，确定总细菌量、活体细菌量和死亡细菌量及其比例

方法二：裂解法

1． 加入11微升固定液（Reagent B）到1.5毫升离心管

2． 用手指轻轻弹动离心管，使其充分混匀

3． 加入1微升染色液（Reagent C）到离心管

4． 用手指轻轻弹动离心管，使其充分混匀

5． 在37℃培养箱里孵育10分钟，避免光照

6． 移出10微升离心管中的混匀物到载玻片上或血细胞计数仪上的一侧样品池里

7． 加入10微升裂解液（Reagent D）到1.5毫升离心管

8． 用手指轻轻弹动离心管，使其充分混匀

9． 在37℃培养箱里孵育10分钟，避免光照

10． 移出10微升离心管中的混匀物到新的载玻片上或血细胞计数仪的另一侧样品池里

11． 放上盖玻片

12． 即刻在荧光显微镜（1000倍）紫外波长滤波器下，观察并计数：显示亮蓝色荧光细菌的为活细菌，而显示暗淡或无荧光细菌的为死细菌或膜损害细菌

13． 建议观察3个显微镜视野，确定总细菌量、活体细菌量和死亡细菌量及其比例

方法三：双重染色

1． 加入11微升固定液（Reagent B）到上述1.5毫升离心管

2． 用手指轻轻弹动离心管，使其充分混匀

3． 加入1微升染色液（Reagent C）到离心管

4． 再加入1微升（1微克/微升）用户自备的碘化丙啶（Propidium Iodide；PI）染液

5． 用手指轻轻弹动离心管，使其充分混匀

6． 放进37℃培养箱里孵育10分钟，避免光照

7． 移出10微升离心管中的混匀物到载玻片上或血细胞计数仪上

8． 放上盖玻片

9． 即刻在荧光显微镜（1000倍）紫外波长滤波器下，观察并计数：显示亮蓝色荧光细菌的为活细菌

10． 变更到红色荧光滤波器下，观察并计数：显示红色荧光细菌的为死细菌或膜损害细菌

11． 建议观察3个显微镜视野，确定活体细菌和死亡细菌的比例

注意事项

1． 本产品为50次操作。

2． 操作时，须戴手套。

3． DAPI为半通透性的染料，可以自由进入细菌。

4． 本产品的裂解液（Reagent D），通常情况下，可以充分溶解细菌细胞，但不排除不同菌种的耐受力；亦可使用异丙醇替代。

5． 细菌稀释性样品（例如河水等）建议观察20个视野计数；浓缩性样品（例如培养菌等）建议观察3个视野计数。

6． 使用载波片细菌计数活体细菌和死亡细菌比例时，建议每个视野计数200个细菌。

7． 使用标准血细胞计数器进行细菌计数时乘上稀释倍数104。标准血细胞计数器（Hemocytometer）的计算方法是：

1毫米方块的细菌计数X 104（稀释倍数）＝实际细菌数/毫升

8． 建议细菌染色后即刻进行观察分析，最长不得超过2小时。

9． 本公司提供系列细菌分析试剂产品。

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