细胞基质金属蛋白酶(MMP2/9)原位明胶酶谱法(insituzymography)荧光染色试剂盒说明书

主要用途

细胞基质金属蛋白酶（MMP）原位明胶酶谱法（in situ zymography）荧光染色试剂是一种旨在通过异硫氰酸荧光素标记的明胶作为底物，针对未固定处理的细胞样品予以染色处理，基质金属蛋白酶切离底物产生高度绿色荧光，来定位细胞中的基质金属蛋白酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物细胞基质金属蛋白酶-2和9的分析。产品即到即用，性能稳定，操作便捷，敏感度高，荧光清晰，重复性好。

技术背景

基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称，因含有金属（锌、钙）离子而得名。迄今为止发现的MMPs至少有28种，几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质（extracellular matrix）成分，同时参与胚胎发育、形态形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、组织再吸收（tissue resorption）、疾病发生，例如关节炎、癌细胞浸入转移等。根据降解的底物不同可将MMPs分为4大类：（1）胶原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和蛋白多糖；（2）明胶酶（Ⅳ型胶原酶）：MMP2、MMP9，又称明胶酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和弹性纤维；（3）基质溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11，主要作用于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹力纤维、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ胶原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金属蛋白酶：MT₁-MMP、MT₂-MMP、MT₃-MMP，主要作用于明胶、Ⅳ型胶原、MMP2。体内绝大多数细胞并不储备MMPs，当需要MMPs的信号传递到细胞后才临时合成，合成的MMPs以无活性的酶原（proenzyme）形式分泌到细胞外，随后被多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理激活，一种激活的MMPs可激活另一种MMPs，形成瀑布效应。原位明胶酶谱法荧光染色（in-situ fluorescence zymography）技术在于提高基质金属蛋白酶检测的敏感性，使用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的明胶作为底物，经过基质金属蛋白酶水解后产生荧光多肽，据此在荧光显微镜下检测酶的活性和位置。

产品内容

胶体液（Reagent A）   1毫升

染色液（Reagent B） 100微升

产品说明书     1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，严格避免光照；其余的保存在室温下；有效保证6月

用户自备

复染液（40049）：用于样品复染

1.5毫升离心管：用于染色工作液配制的容器

盖玻片：用于样品孵育处理

微波炉：用于融化试剂

恒温水槽或培养箱：用于试剂温育或孵育反应物

荧光显微镜：用于样品染色后观察

实验步骤

实验开始前，准备好载玻片上培养的细胞样品。同时室温下融化预热染色液（Reagent B），避免光照。然后进行下列操作。

1． 将胶体液（Reagent A）置于微波炉里加热溶化（注意：功率过大或时间过长会造成溢出或干化）或60℃水浴溶化

2． 小心移取400微升胶体液（Reagent A）到1.5毫升离心管

3． 放进37℃恒温水槽孵育10分钟

4． 同时瞬间37℃预热染色液（Reagent B）

5． 加入50微升37℃预热的染色液（Reagent B），混匀

6． （选择步骤）加入1微升用户自备的复染液

7． （选择步骤）加入4微升用户自备的MMP活化剂

8． 即刻分别加上40微升上述液体到未固定的载玻片上的细胞样品

9． 盖上盖玻片（注意：避免气泡）

10． 放进4℃冰箱里孵育10分钟，或直至胶体凝结，避免光照

11． 放进37℃培养箱里孵育60分钟，避免光照

12． 即刻在荧光显微镜下观察：激发波长480nm，散发波长530nm――绿色荧光增强，表明基质金属蛋白酶活性高

注意事项

1． 本产品为20次（片）操作 

2． 操作时，须戴手套

3． 样品准备要点如下：

a) 细胞样品需新鲜培养，且未予固定处理

b) 样品中避免使用EDTA、EGTA等二价阳离子鳌和剂以及巯基乙醇和DTT等

c) 样品中避免使用硫醇抑制剂（THIOL INHIBITOR）

d) 如果验证样品中基质金属蛋白酶，可以使用EDTA或抑制剂预处理1小时作为对照

e) 操作前，避免清洗细胞样品

4． 建议胶体液（Reagent A）瞬时加热，以防干枯；或采用60℃度恒温水槽加热融化

5． 建议使用10微克/毫升碘化丙啶（Propidium Iodide），作为复染染料

6． 由于MMP-9是酶原形式，用户可以添加活化剂处理，例如APMA（建议使用100毫摩尔胶原酶潜酶活化剂（APMA）—12197.2）

7． 如果样品活性过低，可以增加孵育时间至24小时

8． 注意区分样品的自发荧光

9． 染色参考图像如下：绿色荧光为基质金属蛋白酶；红色荧光为碘化丙啶复染

10． 本公司提供系列基质金属蛋白酶酶谱检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定荧光清晰

使用承诺

用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

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