细胞色氨酸羟化酶(TryptophanHydroxylase)活性比色法定量检测试剂盒说明书

主要用途

细胞色氨酸羟化酶 （Tryptophan Hydroxylase）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过底物色氨酸和四氢生物蝶呤在色氨酸羟化酶的催化下，产生5-羟色胺酸，进而使用福林酚试剂与之反应，生成蓝色产物，呈现吸光峰值的增高，即采用比色法来测定细胞裂解萃取样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取悬液样品（动物、人体、昆虫等）色氨酸羟化酶的总活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

色氨酸羟化酶 （Tryptophan Hydroxylase；TPH；EC1.14.16.4），又称为色氨酸单加氧酶（Tryptophan 5-monooxygenase）是芳香族氨基酸羟化酶家属中的成员，通过将羟基基团加在色氨酸的5’位上，产生5-羟色胺酸（5-hydroxytryptophan；5-HTP），成为神经传递介质5-羟色胺（serotonin）的前体。色氨酸羟化酶分为2个亚型：TPH1和TPH2。前者在外周末梢和中枢神经系统高度表达，例如皮肤、内脏、松果体，后者只在神经元上高度表达。其活性异常将导致与5-羟色胺生成信号通路（serotonergic pathway）有关的精神疾病，包括抑郁、精神分裂、强迫症、自杀行为等的病理演变。基于底物色氨酸和四氢生物蝶呤（tetrahydrobiopterin）在色氨酸羟化酶的催化下，产生5-羟色胺酸和二氢生物蝶呤（dihydrobiopterin），进而使用福林-乔卡尔泰乌酚试剂 （Folin -Ciocalteu phenol reagent），在碱性条件下，与5-羟色氨酸反应，生成蓝色产物，在分光光度仪下（736nm波长）检测，来定量分析色氨酸羟化酶的总活性。其反应系统为：

产品内容

清理液（Reagent A）       120毫升

裂解液（Reagent B）       10毫升

缓冲液（Reagent C）       2毫升

反应液（Reagent D）       250微升

显色液（Reagent E）        2.5毫升

强化液（Reagent F）        2.5毫升

阴性液（Reagent G）       10毫升

产品说明书    1份

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、缓冲液（Reagent C）和反应液（Reagent D）在－20℃冰箱里； 其余的保存在4℃冰箱里；显色液（Reagent E）避免光照；有效保证6月。

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器。

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器。

细胞刮脱棒：用于脱离细胞。

DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞。

（微型）台式离心机：用于样品制备。

比色皿：用于比色的容器。

分光光度仪：用于比色分析。

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

一、 样品准备

1． 准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 107细胞）

2． 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入3毫升清理液（Reagent A），混匀细胞

6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）

7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入200至500微升裂解液（Reagent B），充分混匀

10． 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器

11． 在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约40下） 

12． 将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管

13． 转移到预冷的1.5毫升离心管

14． 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为10000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415）

15． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

16． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

17． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、 测定准备

1． 开启并设定好分光光度仪：波长736nm，并置零 

2． 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；显色液（Reagent E）避免光照

3． 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度；可见绿色结晶析出，静置后取上层使用

三、 背景对照测定

1． 移取80微升缓冲液（Reagent C）到新的1.5毫升离心管

2． 加入10微升反应液（Reagent D）

3． 加入10微升阴性液（Reagent G），混匀

4． 在37℃温度下孵育15分钟

5． 加入450微升阴性液（Reagent G）

6． 加入100微升显色液（Reagent E）

7． 加入100微升强化液（Reagent F）

8． 上下倾倒数次，混匀

9． 在37℃温度下孵育60分钟

10． 转移到1毫升比色皿

11． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照读数

四、 样品测定

1． 移取80微升缓冲液（Reagent C）到新的1.5毫升离心管

2． 加入10微升反应液（Reagent D）

3． 加入10微升待测样品（150微克蛋白），混匀

4． 在37℃温度下孵育15分钟

5． 加入450微升阴性液（Reagent G）

6． 加入100微升显色液（Reagent E）

7． 加入100微升强化液（Reagent F）

8． 上下倾倒数次，混匀

9． 在37℃温度下孵育60分钟

10． 转移到1毫升比色皿

11． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数

五、 计算样品活性

[（样品读数－背景读数）X 0.1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.01（样品容量；毫升）X 25（毫摩尔吸光系数）X 15（反应时间；分钟）]＝单位/毫升

转换：单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

单位＝微摩尔5-HTP /分钟

注意事项

1． 本产品为20次操作，包括背景对照

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，背景测定只需1次

4． 建议使用比色皿测定

5． 样品须澄清，至关重要 

6． 测定值由低到高变化；孵育反应可持续15分钟

7． 比色测定后，比色皿须清洗彻底

8． 样本测定样品读数高于背景读数表明具有酶活性

9． 建议待测样本蛋白浓度为150微克/10微升；如果样本酶活性过低或过高， 则可以增加或降低样本量（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒）

10． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

11． 色氨酸羟化酶单位活性定义为：在37℃，pH 7.4条件下，每分钟内能够产生1微摩尔5-羟色氨酸（5-HTP）所需的酶量作为一个活性单位

12． 本公司提供系列羟化酶酶学检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感

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