组蛋白脱乙酰化酶2（HDAC2）活性荧光法定量检测试剂盒说明书

主要用途

通用型组蛋白脱乙酰化酶 2（HDAC2）活性荧光法定量检测试剂是一种旨在通过荧光探针标记乙酰化多肽底物，在特异性抑制剂的存在下，经过 HDAC2 脱乙酰基后，被位点特异性氨基肽酶水解，释放荧光产物氨甲基香豆素，即采用荧光法来测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞或组织裂解萃取液样品（动物、人体）、核蛋白样品、部分或完全纯化酶样品中 HDAC2 的特异活性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

人体组蛋白脱乙酰基酶（histone deacetylase；HDAC）家属分成三类共20多个蛋白：种类I（class I）与酵母Rpd3蛋白同源，包括HDAC1、2、3、8，存在于细胞核中；种类II（class II）与酵母Hda1蛋白同源，包括HDAC4、5、6、7、9a、9b、10和HDRP/MITR，存在于细胞核和细胞浆里；上述两大种类的蛋白分子催化结构域含有锌，且曲古菌素A（trichostatin A；TSA）敏感。种类III（class III）为NAD辅助因子必需，又称为sirtuins，与酵母Sir2同源，包括SIRT1至7等。其曲古菌素A（trichostatin A；TSA）不敏感。通过催化组蛋白上赖氨酸残基ε氨基酸的乙酰基团的水解脱离，改变核小体（nucleosome）结构达到调节基因表达，从而调节细胞周期和分化，一旦失控，则会导致肿瘤和衰老。HDAC2（EC3.5.1.98），与各种不同蛋白，包括YY1，形成转录抑制复合物，达到转录调节、细胞周期进程、以及发育变化等控制作用。其脱乙酰化目标

序列为 XXXLys（Ac）X。基于乙酰化多肽具有抗氨基肽酶切离的功能，首先通过比色染料氨甲基香豆素（7-amido-4-methyl coumarin；AMC）来标记乙酰化多肽底物，其次，在特异性抑制剂apicidin的差异浓度作用下，进行HDAC2的脱乙酰化，最后底物进一步在氨基肽酶的催化酶解，释放出具有强烈荧光的游离7-氨基-4-甲基香豆素（7-amido-4-methylcoumarin；激发波长360nm；散发波长460nm），由此来定量测定组蛋白脱乙酰基酶2的特异活性。

其反应系统为：

产品内容

缓冲液（Reagent A）    6 毫升

底物液（Reagent B）    250 微升

终止液（Reagent C）    500 微升

酶解液（Reagent D）    500 微升

标准液（Reagent E）    100 微升

专性液（Reagent F）    100 微升

产品说明书          1 份

保存方式2

保存底物液（Reagent B）、终止液（Reagent C）、酶解液（Reagent D）、标准液（Reagent E）和专性液（ReagentF）在－20℃冰箱里，其余的保存在 4℃冰箱里；底物液（Reagent B）避免光照。有效保证 6 月。

用户自备

1.5 毫升离心管：用于样品操作的容器。

培养箱：用于反应物孵育。

黑色 96 孔板或 100 微升 1 厘米光径比色皿：用于荧光分析的容器。

荧光酶标仪或荧光分光光度仪：用于荧光分析。

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

一、 测定准备

1． 准备好待测样品（例如核蛋白或细胞/组织裂解萃取液样品等），置于冰槽里。

2． 设定好荧光分光光度仪（温度为 37℃）：激发波长 360nm，散发波长 460nm，并置零；必要时，调整增益倍数。

3． 准备好 5 个 1.5 毫升离心管，标记为 1 至 5 号管。

4． 分别加入 25 微升缓冲液（Reagent A）到 2 至 5 号管。

5． 移取 50 微升标准液（Reagent E）到 1 号管，混匀。

6． 小心移取 25 微升 1 号管稀释的标准液（Reagent E）到 2 号管，混匀。

7． 小心移取 25 微升 2 号管稀释的标准液（Reagent E）到 3 号管，混匀。

8． 小心移取 25 微升 3 号管稀释的标准液（Reagent E）到 4 号管，混匀。

9． 将 1 至 5 号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

二、 标准曲线测定

1． 移取 55 微升缓冲液（Reagent A）到相应孔里。

2． 加入 5 微升底物液（Reagent B）。

3． 加入 20 微升上述配制的标准液（Reagent E）。

4． 轻轻摇动 96 孔板 30 秒。

5． 放进 37℃培养箱里，孵育 60 分钟，避免光照。

6． 分别加入 10 微升终止液（Reagent C）。

7． 分别加入 10 微升酶解液（Reagent D）。

8． 轻轻摇动 96 孔板 30 秒9． 在 37℃培养箱里，孵育 30 分钟。

10．即刻放进荧光酶标仪或转移到 100 微升比色皿，在荧光分光光度仪里检测：获得标准样品相对荧光读数（Relative Fluorescence Unit；RFU）。

11．重复实验步骤 1 至 10 四次。

12．构建标准曲线：纵座标（Y 轴）为相对荧光单位（RFU）；横座标（X 轴）为标准 AMC 浓度（微摩尔/升）。

三、样品活性测定

1） 总活性测定

13．在 96 孔板上做好相应标记：待测样品总活性。

14．分别移取 55 微升缓冲液（Reagent A）到相应孔里。

15．加入 5 微升底物液（Reagent B）。

16．加入 20 微升待测样品（20 微克核蛋白或 100 微克细胞裂解萃取液总蛋白）（注意：样品须清澈）。

17．轻轻摇动 96 孔板 30 秒。

18．放进 37℃培养箱里，孵育 60 分钟，避免光照。

19．加入 10 微升终止液（Reagent C）。

20．加入 10 微升酶解液（Reagent D）。

21．轻轻摇动 96 孔板 30 秒。

22．在 37℃培养箱里，孵育 30 分钟。

23．即刻放进荧光酶标仪或转移到 100 微升比色皿，在荧光分光光度仪里检测：获得样品总活性相对荧光。

读数（Relative Fluorescence Unit；RFU）。

24．根据标准曲线获得样品总活性对应 AMC 浓度（微摩尔/升）。

2） 非特异活性测定

1． 在 96 孔板上做好相应标记：待测样品非特异活性。

2． 移取 50 微升缓冲液（Reagent A）到相应孔里。

3． 加入 5 微升专性液（Reagent F）。

4． 加入 20 微升待测样品（20 微克核蛋白或 100 微克细胞裂解萃取液总蛋白）（注意：样品须清澈）。

5． 放进 37℃培养箱里，孵育 10 分钟，避免光照。

6． 加入 5 微升底物液（Reagent B）。

7． 轻轻摇动 96 孔板 30 秒。

8． 放进 37℃培养箱里，孵育 60 分钟，避免光照。

9． 加入 10 微升终止液（Reagent C）。

10．加入 10 微升酶解液（Reagent D）。

11．轻轻摇动 96 孔板 30 秒。

12．在 37℃培养箱里，孵育 30 分钟。

25．即刻放进荧光酶标仪或转移到 100 微升比色皿，在荧光分光光度仪里检测：获得样品非特异活性相对荧光读数（Relative Fluorescence Unit；RFU）。

13．根据标准曲线获得样品非特异活性对应 AMC 浓度（微摩尔/升）。

3） 样品活性计算

（1）

样品总活性和非特异活性计算

根据标准曲线获得样品对应 AMC 浓度（微摩尔/升）X 样品稀释倍数]÷ 60（分钟）＝纳摩尔/分钟/毫升

转换：纳摩尔/分钟/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝纳摩尔/分钟/毫克

（2）样品特异活性

样品总活性－样品非特异活性＝样品特异活性

注意事项

1． 本产品为 20 次操作。

2． 操作时，须戴手套。

3． 统操作过程中，标准曲线测定只需 1 次。

4． 样品须澄清，至关重要。

5． 样品处理时，避免使用蛋白酶抑制剂、PMSF、烷基胺（alkyl amine）等。

6． 测定值由低到高变化；测定可以持续 60 分钟。

7． 测定值荧光读数越高，表明酶活性越高。

8． 荧光测定后，比色皿须清洗彻底。

9． 待测样本为核蛋白样品，其蛋白浓度为 0 微克/20 微升；待测样本为细胞/组织裂解悬液，其蛋白浓度为 100 微克/20 微升（本公司提供 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒）。

10．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度。

11．组蛋白脱乙酰基酶 2 单位活性定义为：在 37℃，pH 8.0 条件下，每分钟内能够释放 1 微摩尔 7-氨基-4-甲基香豆素所需的酶量作为一个活性单位。

12．本公司提供系列组蛋白脱乙酰基酶检测试剂产品。

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